ביוכימיה- השפה המולקולארית, הנגזרת מעקרונות יסוד

כימיים ופיזיקליים, העומדת בבסיס קיום החיים

חומר חי

1. אופי מסודר ומאורגן   

2. מקיים חילוף חומרים ואנרגיה עם הסביבה

3. בעל יכולת להתחלק.

שני החוקים הבסיסיים של התרמודינמיקה:

1. חוק שימור אנרגיה - האנרגיה הכוללת של מערכת וסביבתה היא קבועה-

2. אנטרופיה - על מנת שתהליך יקרה באופן ספונטאני האנטרופיה חייבת תמיד לעלות.
אנטרופיה – אי סדר

מערכת חיה היא מערכת פתוחה שמקיימת חילוף חומרים ואנרגייה עם הסביבה, והיא לא מערכת בשיווי משקל עם הסביבה כך שריכוזי החומרים בין תוך לחוץ למערכת היא שונה. מערכת זו בעלת סדר ועל מנת לקיים מצב זה מערכת זו צריכה להשקיע אנרגייה.

מע' מבודדת (סגורה) – לא מקיים חילוף חומרים עם הסביבה.
מע' פתוחה – כן מקיים חילוף חומרים עם הסביבה .

יסודות הכימיה של החומר החי

·       בעיקר P O N H C.

·       יונים- נתרן, אשלגן, מגנזיום..

·       מתכות- בכמות קטנה אבל הכרחיים מאוד- קובלט, נחושת, ברזל, מנגן...
יונים ומתכות מסיעות להעברת אלקטרונים ושימוש במטענים לקיום תהליכים שונים.

היסודות הנפוצים של החומר החי יכולים ליצור ביניהם קשרים וליצור את מולקולות החיים:

מים, בסיסים חנקניים, חומצות אמינו, סוכרים, מולקולות אורגניות אחרות...

קשר קוולנטי: שיתוף אלקטרונים. השיתוף הוא לא בהכרח שווה בשני האטומים, אלא תלוי באלקטרושליליות של כל אחד מהם. קשר קוולנטי יכול להיות פולארי בהתאם לא"ש של שני האטומים:

OH- הקשר הקוולנטי הכי פולארי בטבע

NH- מאוד פולרי

C=0- קשר די פולארי

SH- מעט פולארי

CH- כמעט לא פולארי

קשר סולפידי – הוא קשר קוולנטי חזק שיוצר קשר בין אטומי גופרית ונותן יציבות למבנה החלבון.
יש קשר סולפידי בין שרשרת ויש תוך שרשרת כלומר תוך אותו פפטיד.

קשרים לא קוולנטים:

1. איטראקציות אלקטרוסטטיות: משיכה או דחייה בין שני מטענים לפי חוק קולון E=(K*q1*q2)/ Dr

2. קשרי מימן: בין אטום מימן הקשור לאחד מיסודות N,O,F לאטום N,O,F אחר.  ניתן למצוא קשרי מימן בין זוגות בסיסים בדנ"א. מומנט דיפול קבוע.

3. קשרי ון דר ואלס: מקורם בצפיפות האלקטרונים של שני האטומים. התפלגויות מטען זמניות גורמות למומנט דיפול רגעי.

4. אינטראקציות הידרופוביות: אינטרקציה הידרופובית יוצרת קשר בין מולקולות על מנת להקטין את ממשק המולקולות עם המים.
פירוט:

על מנת להבין אינטראקציות הידרופוביות יש לדעת מהן תכונות מולקולת המים:

א. מולקולה פולרית בעלת מומנט דיפול.

ב. מולקולות שנוטות ליצור צברים (סידור מסוים).

ג. מים מחלישים (ממסכים) אינטראקציות יוניות- כל יון שנמצא במים מוקף ע"י מולקולות מים וכתוצאה המטען האפקטיבי שלו קטן- מידת יכולת ההשפעה שלו על יון אחר הנמצא בתמיסה ממוסכת ע"י מולקולות המים שנמצאות ביניהם.

אם כן, אינטראקציות הידרופוביות מבטאות את "העדפתן" של מולקולות א-פולריות להתקבץ עם עצמן מאשר להיות מומסות בנפרד ע"י מולקולות המים.
לאפקט ההידרופובי יש תפקיד חשוב בקיפול חלבונים בזכות התכונה הזו.
הידרופובי צמוד אחד לשני פנימה – שונא מים , הידרופילי החוצה כי הוא אוהב מים.

אלה אינטראקציות מונעות אנטרופיה אשר נובעות מתכונות המים כממס ולא מתכונות המומס.

כאשר המומס מתקבץ עם עצמו, מולקולות המים שבתמיסה יכולות להתפזר באופן חופשי יותר.

כל האינטראקציות הלא קוולנטיות הן אינטראקציות הפיכות בקלות (בניגוד לקשרים קוולנטיים) בעלות חשיבות רבה בתהליכים ביוכימיים בתא כגון: הכפלת דנ"א, קיפול חלבונים למבנה תלת מרחבי ייחודי, הכרת אנזים סובסטרט, מע' העברת סיגנלים.A1] 

למים השפעה מהותית על היווצרות/ חוזק האינראקציות האלו.

מבנה ותפקוד חלבונים

חלבונים הם המביאים והמוציאים אל הפועל של כל הפעילויות של התא. חלבונים הם פולימרים הבנויים מחומצות אמינו. הם בעלי קב' פונקציונאליות (R) שונות וביכולתם להקשר למולקולות אחרות בתאים. מבנה של חלבונים מסוימים הוא קשיח ושל אחרים גמיש- תכונה החשובה לתפקוד.

חומצות אמיניות

בטבע קיימות 20 חומצות אמיניות, וכל שלושה בסיסים בדנ"א הם קודון לחומצה אמינית אחת.

המבנה שלהן: פחמן אלפא הקשור לקבוצה אמידית, קבוצה קרבוקסילית, אטום מימן ושייר צידי. ההבדל בין ח"א אחת לשנייה הוא בקבוצה ה-R אשר מקנה לה את אופייה הייחודי.

כל החומצות האמיניות מהן בנויים חלבונים הן בקונ' אבסולוטית S (איזומר L). כאשר יש בה שני מרכזים כיראליים כל אחד הוא L.

חומצות אמינו חיוניות הן וחומצות אמינו לא חיוניות

תכונות היוניזציה של חומצה אמינית חופשית

מידת הפרוטונציה של הקצוות האמידי והקרבוקסילי של חומצה אמיני הם תלויי pH.

יש גם ח"א שהשייר שלהן יכול לקבל/ למסור פרוטון ולקבל מטען.

צוויטריון – תכונה יוניזציה של חומצה אמינית חופשית כאשר בצד אחד הוא חיובי וצד שני שלילי ולכן הוא צוויטריון.
למעשה בדר"כ כאשר המטען הכולל הוא אפס כולל הקצה אמידי, קרבוקסילי ושייר וגם תוך התחשבות ב-PH.

תכונות של חומצות אמיניות שונות:

·       ח"א אליפטיות (הידרופוביות שאינן ארומטיות)- לדוג' ואלין, לאוצין, איזולאוצין, מתיונין

פרולין- חומצה יוצאת דופן בין החומצות האמיניות. זאת משום שהשייר האליפטי שלה מתקפל על עצמו ליצירת טבעת. תכונה זו גורמת לכך שנוכחות פרולין בחלבון מסויים תקנה לו קשיחות.

·       ח"א בעלות שייר צדדי ארומטי: פניל אלנין, טירוזין, טריפטופן.

לח"א אלה יש תכונה חשובה של בליעת UV- חשוב בשיטות של זיהוי חלבונים. טריפטופן בולעת אורך גל 280nm.

·       ח"א בעלות שייר צדדי פולרי: סרין, טריאונין, ציסטאין.

שיירים של סרין וטריאונין יכולים לעבור פוספורילציה- תהליך החשוב לרגולציה של תפקוד חלבונים.

שיירי ציסטאין יוצרים קשרי ציסטאין התורמים לייצוב מבנה שלישוני של חלבון.

·       ח"א בעלות שייר צידי חומצי: בעלות קבוצת COO^-. נוטות למסור פרוטון ולכן בעלות מטען שלילי. למשל אספרטאט וגלוטמאט.

·       ח"א בעלות שייר צידי בסיסי: בעלות קבוצת NH₃⁺. נוטות לקבל פרוטון, ולכן בעלות מטען חיובי. למשל ארגינין ליזין היסטידין

חשוב חשוב ^

קשר פפטידי:

בין קצה אמידי של ח"א אחת לקצה קרבוקסילי של ח"א שנייה. את השרשרת הפוליפפטידית קוראים מקצה N טרמינלי לקצה C טרמינלי. בחיבור זה נפלט מולקולת מים .

הקשר הפפטידי מיוצב ע"י רזוננס. כתוצאה מתקבל קשר פלנארי קוטבי.

לקשר הפפטידי תכונות בין אלו האופייניות לקשר כפול לאלו האופייניות לקשר יחיד.

שרשרשרת פוליפפטידית:

מרכיב השרשרת הפוליפפטידית הוא משלד, רצף חומצות אמינו, קצה אמיני בצד שמאל וקרבוקסילי בצד ימין, שיירים של חומצות אמינו R נבלטות מהשלד.
רצף חומצות האמינו מקודד ע"י הדנ"א כי הוא מקור החלבון.
הקריאה של החומצה האמינית יהיה משמאל מהקצה האמיני לימין לקצה הקרבוקסילי. 

דרגות חופש סביב הקשר הפפטידי:

דרגות חופש מבטאות את אפשרות הסיבוב סביב קשרים היחידים (פחמן אלפא) בכל חומצה אמינית, האופיינית למבנים שניונים.
- יש זוית פאי לחומצה אמינית אחת שיכולה לנוע 180 מעלות ויש זוית פסאי לחומצה אמינית הסמוכה שגם היא יכולה לנוע 180 מעלות וליצור סיבוביות.
- ההגבלה לזוית נוצרת מהשיירים למשל שיכולה לעשות הפרעה סטרית אם הוא טעון או גדול הוא יכול להגביל את הזוית שתיצור כך שכל אחת תעשה עד 180 מעלות. אם תהייה הפרעה מהשיירים או מהסביבה אז יהיה פחות.
- בעקרונו השייר נוטה להיות בצורה של טראנס שייר אחד למעלה שייר הבא למטה וכך לאורך כל הפפטיד.
- יש שתי זוויות סיבוב בקשר הפפטידי. אלה זוויות שבהן יש שינוי של כיוון השרשרת הפוליפפטידית – פאי ופסאי

הרצאה מס' 2

הידרופוביות בחומצות אמיניות:

יש חומצות אמינו עם שיירים הידרופובים (שונאי מים) / הידרופילים (אוהבי מים), ולתכונה זו היא בעלת תפקיד חשוב בקיפול החלבון.  
ישנו סקאלת הידרופוביות של חומצות אמינו והנטייה היחסית שלהם להעדיף סביבה הידרופובית והמדד נקבע על פי אנרגייה חופשית- כאשר מחממים ובודקים כמה אנרגייה נדרש כדי לשבור את הסדר.
בהקשר לחלבון ישנו קשר חשוב בקביעת מבנה בקיפול החלבון. לכל חומצה אמינית יש דירוג הידרופוביות משלה.

קשר פפטידי: יש אל איתור, בין קשר בודד לקשר כפול. אנרגית האקטיבציה לשבירת הקשר היא מאוד גבוהה, ולכן בטמפ' החדר הקשר הזה לא מתפרק (גם לא בטמפ' הגוף).

גמישות בשלד הפפטיד:

אנזים מסוים יודע לחבר בין שני חומצות אמינו, קשר פפטידי כזה הוא קשר פלנרי שטוח מישורי הגמישות בו מוגבלת הוא לא גמיש. יש אזורים ספציפים שיכולים כן לנוע כמו שני צידי פחמן אלפא זה קשר שיכול לנוע. לפי פאי ופסאי כל אחד מצידי הקשר פחמן אלפא יכול לנוע 180 מעלות.
 זה מבטא את דרגות חופש - דרגות החופש F ו Y מבטאות אפשרות סיבוב סביב הקשרים היחידים בכל חומצה אמינית. הזויות F ו Y קובעות את מהלך השרשרת הפפטידית.
החומצה אמינית עצמה קשיחה לא זזה אבל בין אחת לשנייה כל אחת מהן יכולה לנוע 180 מעלות כל צד של פחמן אלפא כמו אם נחבר שתי מחברות בקצוות אחת לשנייה אז נוכל להפוך כל מחברת לכיוון שלה ב-180 מעלות.

אנו נראה כי יש להן תפקיד חשוב בקביעת היררכיית הארגון המבני.
היכולת שלהן לנוע לא תמיד תהייה מקסימלית הכול תלוי בשייר ובהפרעה סטרית וזה קובע את המגבלה של זוית פאי ופסאי.
אומגה W הוא קשר פלנרי שטוח, שינוי זוית היא אפס, לא גמיש
- חשוב: ע"פ השיירים של חומצות אמינו נוכל לקבל מידע על החלבון עצמו איך יתקפל.

היררכיה והארכיטקטורה של חלבונים:

מבנה ראשוני

רצף לינארי של חומצות אמינו.
רצף חומצות אמיניות מביא לחלבון, יצירת שרשרת פוליפפטידית בעלת רצף מוגדר המקודד עי הדנא. חלקים מה-דנ"א מקודדים לחלבון ולא הכול בעיקר אצל בני אדם.
למה חשוב לחקור לרצף חלבון? יש לכל אחד תכונה משלו ונוכל לדעת מה התרומה שלה, ללמוד על החלבון או חלבונים אחרים ולקשר מידע בין חלבונים, ייתכנו אזורים דומים בין חלבונים. למשל אזור קשירת דנא יש אזור קבוע שדומה לכולם בין חלבוני קושי דנא. מה היה הגן שקודד אליו, תכונות יחודיות לו וגם לאחרים.

אם נסתכל על האיור האחרון נוכל לשים לב לכמה נקודות חשובות:
- שלד חלבוני זה פפטיד בונד הכולל: קשר פפטידי בין חומצות אמינו, שלד בסיס, פחמן אלפא ללא שיירים.
- השלד הזה יש לו פוטנציאל גדול של קשרי מימן בזכות קבוצות קרבוניליות ואמינו בקצוות (וגם מהשיריים יש אם טעונים או הידרופובים) אבל גם לשלד עצמו יש קשרי מימן.
- נוכל לראות שיש דרגת חופש גבוהה באזור בו יש כמה שפחות שיירים בגלל פחות הפרעות סטריות של שיירים המהווים הפרעות מקומיות.
- אם פפטיד ארוך ומקופל יכול להיות הפרעות גם סביבתיות עם קשרים נוספים מהסביבה אולי עם חלבונים אחרים או בתמיסה עצמה.
- השיירים מסודרים בטראנס אחד לשני לסירוגין מסיבות הפרעות סטריות .

מבנה שניוני

הרצף הלינארי של חומצות אמיניות ממבנה ראשוני מתארגנות למבנה מקומי שניוני, התוצאה סידור מחזורי של חומצות אמיניות במבנה שחוזר על עצמו - ארגון מרחבי ייחודי של ח"א סמוכות זו לזו ברצף הלינארי. יש שתי צורות ארגון אפשריות:

צורה אחת: אלפא הליקס- התארגנות בצורת סליל לאורך ציר סימטריה ימני בגלל סיבות של דחייה סטרית. הסיבה שהמבנה הזה מתארגן ככה הוא קשרי מימן. [ראה סכמה במצגת] הקשר הוא בין חמצן של קב' קרבונילית למימן הקשור לחנקן שנמצא 4 שיירים הלאה. יש רשת של קשרי מימן שמייצבים את המבנה בצורה של סליל.

מאפייני הסליל:

Rise- התקדמות פר חומצת אמינו= 0.15nm

Pitch- התקדמות פר סיבוב= 0.54nm

מספר שיירים לסיבוב- 3.6.

מה מיקום הקב' הצידיות בסליל?

סדר זה משמר על שיירים פונות כלפי חוץ כדי לשמור על דחייה מינימלית. הם בולטים כלפי חוץ, אם השיירים הידרופילים הוא יוצר קשר עם הממס זה יתרון.
צד אחד הידרופובי צד שני הידרופילי ולכן הוא נקרא אמפיפתי.

גדילי ביתא - השרשרת הפוליפפטידית מאוד פרושים, ישרים, לא מקופלים. גם כאשר השרשרת פרושה יש פוטנציאל קשרי מימן גדול בין שני הגדילים. גם פה יש קב' צידיות בעלות משמעות חשובה. הן מסודרות פעם למעלה פעם למטה לסירוגין למנוע הפרעות סטריות. סידור מישורי של חומצות אמינו. מה שמחזיק את המבנה הצורה זה קשרי מימן של השיירים בדומה לאלפא אליקס. הקיפוף הוא בגלל הזוית על פחמן אלפא (הדרגת חופש) ולכן הוא קצת גלי כזה.

- אינם פלנרים לחלוטין - הגדילים נארזים בזוויות אחד ביחס לשני כדי למקסם את האינטראקציה בין הגדילים.

- אנטי מקביל יציב יותר – מתקיים סידור קשרי המימן ישר יותר, ולכן המבנה יציב יותר. נוצרת רשת אינטרקציות קשרי מימן אידיאלית.

איך משנה השרשרת הפוליפפטידית כיוון? קיפול מתקיים ע"י חומצה אמינית כמו גליצין אלנין חומצה הנדרשת בעלת דרגת חופש גבוהה עם שייר קטן או ללא שייר כדי שתהייה זוית גדולה של פאי ופסאי המאפשר את הקיפול.
פרולין- קב' צידית נסגרת חזרה על השרשרת העיקרית. מבנה שלא עוזר ליצירת מבנה מחזורי

אוכל לדעת באמצעות רצף על חלבון איך יתקפל? יהיה אלפא או בטא? האם לפי סוג החומצה האמינית ניתן לחזות באיזה מבנה תעדיף להסתדר?

לכל חומצה אמינית יש נטייה שונה להמצא במבנה שניוני.

על פי איסוף של נתונים למדו על נטייתן של חומצות האמינו להסתדר באופן כזה או אחר, ובנו סקאלה מסויימת. (עוד טבלה כיפית)...

עם זאת, קשה להסתכל בקלילות ולהבין על הרצף ולחזות את המבנה הכולל מאחר ומדובר באתגר חישובי עצום.

הדגמת הקשר בין מבנה שניוני לתפקוד- ראה מצגת- ציור של קולגן- 3 סלילי אלפא הליקס שזורים זה בזה יוצרים צמה חזקה מאוד. קולגן הוא חלבון שיוצר סיבים הנפוץ בעיקר בעצמות ובגידים. הקולגן הוא מבנה סופר שניוני מבכיוון שיש אריזה של מספר מבנים שניוניים יחד.

דוג' נוספת היא חלבון המשי. בנוי אלנין (או סרין) וגליצין. גדילי ביתא נארזים ויוצרים משטח קפלים. אריזה אופטימילת המעניקה הרבה חוזק.

איך משנה השרשרת הפוליפפטידית כיוון במשטחי הביתא?

יש שני סוגי כיפופים:

·       כיפוף ביתא: קטע המורכב מ-3 עד 4 שיירים. זה כיפוף מאוד אדוק שנוצר באמצעות 3 ח"א. מה שיוצר את הכיפוף זה קשרי מימן בין שייר 1 ל-3. ח"א שיוצבו בכיפופים אלה: כאלה עם שיירים קטנים (לדוג' גליצין ופרולין). באופן כזה הגדיל עושה "פניית פרסה" ומתקבל מבנה אנטי מקביל

·       לופים (לולאות אומגה): כיפוף בצורת לופ- יוצרות אותו יותר מ-3 ח"א. ע"י לופ נוצר כיפוף שיוצר מבנה מקביל.

מוטיבים של אלמנטים שניוניים המופיעים תדיר בחלבונים:

הליקס מוטיב, מוטיב קויל, הליקס בנדל, ביתא אלפא ביתא, וכו' וכו' ראה שקופית במצגת.

כל מבנה שניוני מתאפיין בצירופים שונים של פיי ופסיי (לראות דיאגרמה במצגת). עבור כל מבנה יש זוויות מותרות ואסורות. זה נובע משיקולי כוחות פיזיקליים, בעיקר דחייה סטרית. מבנים שניוניים שונים נוצרים לפי טווח זוויות מוגדר מאוד.

דיאגרמת רמצ'אנדראן היא דיאגרמה המראה את הקומבינציות המותרות של פיי ופסיי במבנים שניוניים שונים.

מבנה שלישוני

מתחם - איזור קומפקטי בעל גרעין הידרופובי המקופל על עצמו. גודלו בין 25-400 חומצות אמיניות. יכול להיות בעל תפקיד פונקציונלי או מבני כמו למשל קישור בדנ"א. חלבון יכול להכיל הרבה מתחמים והוא עדיין ייחשב מבנה שלישוני, אין קשר בין השניים.
מבנה שלישוני - מבנה שמתקבל כאשר אזורים שונים של השרשרת הפוליפפטידית נארזים אחד מול השני לקבלת מבנים מקופלים. כלומר קישור של כמה מתחמים או לא בהכרח מתחמים ליצירת מבנים כלשהם.

סידור במרחב של מבנה שלישוני התלת מידי יכול להכיל סוג אחד של מבנה או תערובת של כמה או אפילו מבנה רדומלי.

-מיוגלובין: קושר חמצן בשריר. לאחר קיפולו ליצירת מבנה תלת מימדי החלבון מסוגל לבצע את תפקידו. חלבון זה מורכב כולו מסלילי אלפא. זהו חלבון קומפקטי לא סימטרי.  

-מראה ציור שבו פני שטח החלבון הוא חומצות אמינו טעונות, ואלה ההידרופוביות בפנים. זו התפלגות ח"א שמאפיינת חלבונים מסיסים במים (רוב החלבונים).

-אחד מכללי האצבע הנכון לרוב החלבונים: פני שטח פולרי, ליבה הידרופובית.

כוחות המייצבים את מבנים שלישונים בחלבונים והקיפול:

 שרשרת פוליפפטידית היא שרשרת לינארית המורכב מח"א בעלות אופי שונה. כל מבנה של חלבון הוא מאוד מוגדר, מסודר, ספציפי. מנוגד לרעיון האנטרופיה. מה מעודד את הקיפול???

-       אינטראקציות הידרופוביות: שיירים הידרופוביים נמשכים זה לזה ומתרחקים מהמים.

-       אינטראקציות לא קוולנטיות בין שיירים הרחוקים זה מזה (קשרי מימן, קשרים אלקטרוסטטים, אינטראקציות סטטיות- בין טבעות ארומטיות)

-       קשרים קוולנטים בין שיירים: קשרי S-S- קשרי דיסולפיד בין שיירי ציסטאין. יכולים להיות בתוך אותה שרשרת או בין שתי שרשראות.

[ מראה ציור של חלבון עם קשרי דיסולפיד]

איך משרים אי-קיפול בחלבונים?

דנטרוציה של חלבון:

גואנידיום כלוריד ואוראה: ראגנטים שמפרקים חלבונים. יש להם פוטנציאל קשרי מימן מאוד חזק, הם משנים את מבנה המים ובכך הם מחלישים את אפקט ההידרופובי זו הנטייה לדנטורציה.
הריאגנטים האלה משנים גם את מבנה המים. מפרים את הסדר בתוך המים ע"י יצירת קשרי מימן על המולקולות של המים. אם משנים את מבנה המים משנים את הכוחות המושפעים ממבנה המים, כמו למשל האפקט ההידרופובי. בעצם באופן עקיף הריאגנטים האלה פוגעים גם באינטראקציות ההידרופוביות. באמצעותם פירקנו את הקשרים הלא קוולנטים.

בעזרת ריאגנטים אלו וחיזור קשרי די סולפיד (ע"י ביתא מרקאפטו אתנול) המהווה פירוק קשרים קוולנטים אפשר לגרום לדנטורציה של חלבון כך שכל הקשרים מתפרקים.

[טבלה של דרכים לעשות לחלבונים דנטורציה במצגת]

הניסיונות של כריס אנפינסן (1963):

עשה שורה של ניסיונות שהגדירו שכל המידע הדרוש לחלבון על מנת להתקבל נתונה אך ורק ברצף.

רצף->מבנה->תפקוד.

לקח חלבון ריבונוקלאז. בעזרת הריאגנטים אוראה ובטא מקרפטו אתנול גרם לפרישת השרשרת שלו. התקבלה שרשרת אקראית ללא קשרי SS או אינטראקציות לא קוולנטיות.

כמובן שברגע שנהרס המבנה החלבון לא תפקד.

בשלב הבא הוא לקח את המבנה הדנטורטיבי והסיר את גורמי הדנטורציה.

אח"כ ראה שהמבנה המקופל התקבל שוב. ראה זאת משום שהחלבון חזר לתפקד.

והמסקנה המתבקשת: כל האינפורמציה למבנה התלת מרחבי תלויה ברצף!

המבנה הנטיבי הוא המבנה בעל האנרגיה החופשית הנמוכה ביותר. (G)

קשר די סולפידי מחזיק באופן ראשוני ואז נחתך במקום מסוים ומתחבר מחדש. למה היה צריך את החלק שיצא? כי הוא עוזר ליצור את המבנה בזכות התכונות שהיו לו.

מבנה רבעוני

מספר שרשאות פוליפפטידיות המסוגלות להתאגד ליצירת אוליגומר. כל שרשרת פוליפפטידית היא תת יחידה. תת היחידות יכולות להיות זהות או שונות. בפועל חלבון המורכב ממספר שרשראות פוליפפטידיות.

שרשרת אחת של פפטיד – תת יחידה
כאשר יש יותר מתת יחידה אחת יש יכולת ליצור מבנה רביעוני (לא להתבלבל)
מונומר – יחידה אחת
דימר – 2 יחידות
2 יחידות זהות – הומודימר
2 יחידות שונות – הטרו דימר

מיוצב ע"י קשרי מימן, אינטראקצות אלקטרוסטטיות, אינטראקציות הידרפוביות, קשרי ואן דר ואלס, ולעיתים קשרי ציסטאין (קשרים סולפידים).
קשר סולפידי – הוא קשר קוולנטי חזק שיוצר קשר בין אטומי גופרית ונותן יציבות למבנה החלבון.
יש קשר סולפידי בין שרשרת ויש תוך שרשרת כלומר תוך אותו פפטיד.

קישור מבנה לתפקיד:

בסופו של דבר חשוב להבין שהמבנה משרת את תפקיד החלבון, ברגע שהמבנה לא טוב אז אין התאמה לקיום תהליכים לא יהיה קשר מיטבי בין סובסטראט לאנזים לא תהייה התאמה במיקום אתר פעיל.

הרצאה 3- חקר חלבונים- שיטות

שיטת רדוקציה: כלי פשוט להסתכל על הפונקציה של החלבון, בנפרד במבודד מהסביבה המורכבת שלו. יש בזה חיסרון בגלל שאנחנו לא לומדים על האינטראקציות שלו עם הסביבה, עם חלבונים אחרים.

בשיעור זה נתעסק באיך אפשר לבודד חלבון מסביבתו, מהסך הגדול של החלבונים בתא, על סמך מה ואיך מפרידים.

תכונות חלבונים שמשמשות כבסיס להפרדה:
מסיסות, גודל או משקל מולקולרי, מטען וזיקה (affinity)

קיימות שיטות להפרדת חלבונים לצורכי בידוד ולצרכי אנליזה – לפרק למרכיביו ולבחון כל חלק בניסיון להבין את המבנה.

מונחים לפירוק: רדוקציה, אנליזה, בידוד, פירוק,

הקדמה + שלב ראשוני:

אם נניח אני רוצה לחקור חלבון בעגבנייה אז מה השלב הראשוני שלי?
בשלב הראשוני כאשר אנו לוקחים תא למשל ואני אני רוצה למדוד פעילות בתא שיש לו 20 אלף חלבונים כמות גבוהה של חלבונים קשה לעקוב אחריי כל חלבון אז נעשה בידוד חלבון שרלוונטי לי תוך שמירה על התכונות שלו על המבנה שלו ולבדוק אותו באופן בודד. למעשה נלמד איך ממיקס גדול של חלבונים נוכל לבודד חלבון ספציפי ולחקור אותו.

אנחנו צריכים למצוא דרך יותר נגישה ולכן אנחנו קודם כל נטחן אותו כך נפרק את הממברנות של התאים (הומוגנציה). לאחר מכן אנחנו יכולים להכניס את זה למכשיר הצנטריפוגה – מכשיר מסתובב מעגלי כמו מכונת כביסה ובאמצעות מהירות הכוח הצנטריפוגלי הוא ממיין את כך שבמשקע אמצא חלקים מאוד קטנים ואם ארצה למיין עוד אז אבצע על המשקע שלי עוד פעם צנטריפוגה אבל רק על המשקע ואז אמצא רכיבים יותר קטנים במשקע וכך הלאה.
כמה הערות:
-חשוב לא לפגוע במבנה של החלבון כי ברגע שנפגע בחלבון אנחנו לא נצליח לבדוק אותו כמו שצריך כי אם נרצה לקחת אותו ולבדוק את הפעילות שלו אנחנו כבר לא נוכל.
-אם יש מידע מוקדם למשל אני יודע מי הסובסטארט שלו וברגע שאני מחבר לו את הסובסטראט אני מקבל למשל מולקולה ארומטית בולעת אור ולדעת לעקוב אחריו.
-כל שלב שאני עושה בניקיון חשוב לוודא מה יעילות הניקוי שלי ביחס לפעולה עצמה שבסוף לא אזרוק את התינוק למים (שלא אזרוק בטעות את החלבון שלי).
- אני משתמש בכמה שיטות ברצף שיהיו יעילות לחלבון הספציפי שאני מעוניין לבדוק.

אחריי שפתחתי את התאים הפרדתי (בצנטרפוגה) ויש לי תמיסה נוזלית הומוגנית ממוקדת ואוכל להתחיל לעבוד ולהתחיל למיין חלבונים על סמך תכונות של החלבונים. כך שמתוך המרק הזה של מלא חלבונים להתחיל לעשות תהליכים של הפרדות:

כיצד נזהה את החלבון שלנו?
מבחן assay לחלבון הבוחן מספר תכונות ייחודיות כך שהביוכימאי יוכל לזהות שהחלבון אכן נמצא בתמיסה שהופרדה. ככל שהמבחן יותר ספציפי, כך הניקוי יותר אפקטיבי.

מבחן assay- מבחן לזיהוי חלבונים- קריטריונים:

על המבחן להיות:

1. כזה שנקבע על פי הפעילות הספציפית של החלבון

2. אפקטיבי

3. כמה שיותר רגיש

4. כמה שיותר פשוט

אומדן לניקוי חלבון

באמצעות ידיעת פעילות החלבון. מצריך ידיעה מוקדמת על מה החלבון עושה.

תיאור ריאקציה של הידרוגנז: מעורב בתהליך של יצירת גלוקוז.

ניתן לעקוב אחרי הריאקציה לפי מעקב של הבליעה.

פקטור נוסף חשוב הוא לא רק הפעילות של האנזים אלא גם כמות החלבונים הכוללת בתמיסה. המטרה היא להעשיר את הפרקציה של החלבון נושא הפעילות.

עושים לחלבון מבחן פעילות שאופיינית לו. נמדוד את התקדמות הריאקציה שמזורזת ע"י אותו החלבון.

פעילות ספציפית- פעילות של החלבון כפונקציה של הזמן שמחולקת בסה"כ כמות החלבונים הכוללת בתמיסה.

ככל שהפעילות הספציפית בשלב מסויים גבוהה יותר נסיק שיש לנו בתמיסה פרקציה גדולה יותר של החלבון המבוקש.

הפרדה ראשונית למרכיבי תא:

הומוגנט: לוקח תאים ושובר אותם.

צנטרפוגציה: הפרדה בין פרקציה מסיסה ולפרקציה ששוקעת.

כך נקבל פרקציה של גרעינים ובתמיסה יהיו הרבה חלבונים מסיסים

שלב נוסף: הפרדה בין חלבונים מסיסים למיטוכונדריות ע"י צנטרפוגציה נוספת.

הלאה: הפרדה של חלבונים מסיסים מאברונים אחרים.

בצנטרפוגציה הדרגתית נשארים עם פרצית החלבונים המסיסים- פרציה ציטוזולית.

לאחר שקיבלנו את הפרקציה שבה אמור להימצא החלבון ברצוננו לבודד אותו מיתר החלבונים:

נעשה זאת ע"י קולונה המפרידה בין החלבונים על פי תכונות של: מסיסות, מטען, גודל, ואפיניות.

הפרדה לפי מסיסות שיטה  Salting outע"י מלחים:

לכל חלבונים יש רמת מסיסות שונה התלויה בשיירים הטעונים ויכולים להשפיע על האינטראקציה שלהם עם הסביבה ולכן אם אני אקח את התמיסה שלי ואוסיף מלח אני משפיע ומשנה על החוזק היוני של התמיסה. אני מוסיף מלח אמוניום סולפט בכמות מסוימת ונגרם לשיקוע של חלבונים – חלק מהחלבונים כבר לא מסיסים בתמיסה.
אני יכול לקחת את התמיסה לצנטרפוגה ומי שמסיס יהיה בנוזל העליון ומה שלא מסיס ישקע.

אם אני רוצה לעשות מדרג נוסף של מסיסות נוספת אני יכול לעשות סבב חוזר כלומר להוסיף עוד מלח ואז להכניס לצנטרפוגה ואז חלבונים שאיבדו את המסיסות (פחות מסיסים מקודם) יהיו במשקע וכך אוכל לדעת ולמיין לפי מסיסות.
אחרי שהפרדתי את החלבונים אני יכול להחזיק לסביבה מימית ללא מלח ואז החלבון תחזור לתפקוד ולהיות מסיסה.

אמוניום סולפט הוא חומר יוני שממסך אינטראקציות אלקטרוסטטיות וגורם לחלבון לשקוע.

אח"כ לוקחים את הפרקציות שהתקבלו ונפטרים מהריכוז הגבוה של המלח.

הפרדה לפי צפיפויות – גרדיאנט צפיפויות:

אולטרהצנטרפוגה – בניית גדיאנט צפיפויות באמצעות מלחים שנחלק את המבחנה לפי גרדיאנטים של צפיפויות נעביר בצנטרפוגה וכל חלבון יגיעו לנקודה בה הנקודה שלהם משתווה הצפיפות לגרדיאנט אז לא משנה כמה כוח אני אפעיל בצנטרפוגה החלבון ישאר בגרדיאנט הזה הוא יפסיק לנוע הכוח לא יעבוד עליו.

הפרדה על סמך גודל – דיאליזה:

אפשר להפריד את מולק' החלבון ממולק' המלח (משלב הקודם) ע"י דיאליזה- מפריד בין מולק' גדולות לקטנות:

מכניסים את תערובת החלבונים לתוך שקית דיאליזה שזו ממברנה חצי חדירה שמתאימה למעבר רק של מולק' קטנות – יש סוגים של דיאליזות לפי גודל הקטוף (חורים של רשת בלתי נראית). שמים את שקית הדיאליזה בתוך מיכל מים מזוקקים והנטייה של המלחים לאזן ולצאת החוצה אל מים. כל פעם נחליף את המים כדי שהמלחים יצאו החוצה. כך אני מסנן לפי גודל.

במצב של ש"מ רוב המולק' הקטנות יצאו החוצה לממס מסביב ובתוך השקית יישארו המולק' הגדולות.

הפרדה לפי גודל: פילטרצית ג'ל: כרומטוגרפיה מסננת מולקולרית הפרדה לפי גודל - chromatography size exclusion:

אפשר לארוז בתוך קולונה גרגרים או חרוזים פורוזים (נקבוביים) ואינרטיים, מג'ל לא מומסים במים. בחרוזים ישנן תעלות קטנות המאפשרות למולקולות קטנות לעבור דרכן. שופכים לקולונה את תמיסת החלבונים מה שיקרה:
-המולקולות הקטנות יעברו דרך החרוזים ולכן יעשו דרך ארוכה יותר עד למבחנות למטה – מסה מולקולרית קטנה
-המולקולות הגדולות לא יוכלו להיכנס לחרוזים ולכן יצאו ישר למבחנה – מסה מולקולרית גבוהה
-המולקולות הבינוניים יצאו באמצע מן הסתם.

לכן סדר יציאת המולקולות למבחנה יהיה מהגדולות לקטנות, זה מאפשר לנו מיון לפי גודל.
ויש קשר ישיר בין מסה מולקולרית לבין גודל ולכן נוכל לקבוע בתרשים כך.
לאחר מכן אוכל לקחת מבחנות לפרקציה ולבדוק מה יש בה.

כרומטוגרפיה הפרדה לפי מטען:
lon exchange chromatography

ניקח קולונה מיוחדת שהגרגרים שלהם בעלי אופי מיוחד: מחוברים לקב' פונקציונאלית שלילית או חיובית.

אם נזרים את החלבונים דרך הקולונה: אם בקולונה יש מטענים חיוביים מה שיקשר זה רק חלבונים בעלי אופי שלילי. מה שיירד למטה במורד הקולונה יהיו חלבונים טעונים חיובית. יעברו דרך הקולונה מבלי להקשר.

לאחר התהליך הזה אפשר לשחרר את החלבונים שנותרו בקולונה ע"י: הכנסת חומר יוני (מלח) שיתחרה על הקשר עם הקב' הפונקציונאליות עם החלבונים הקשורים. מכניסים את המלח בגרדיאנט הולך ועולה- ככה יוצר הפרדה לפי רמת מטען. אלא שישתחררו אחרונים יהיו עם מטען שלילי מאוד.
דרך נוספת לשחרר את החלבונים שנותרו בקולונה היא להוסיף בופר שישנה את PH וישפיע על מטען.

את מה שיוצא מהקולונה אוספים בפרקציות ומודדים כמה יש בכל מבחנה, אני יכול לשחק בPH לפי הבחירה שלי כך שיצא בסוף פרקציות שונות עם מטענים שונים.

כרומטוגרפיה הפרדה לפי זיקה (אפיניות) - affinity chromatography:

מבוססת על מידע מוקדם שיש לי על החלבון- ידיעת הפונקציה של החלבון.

קולונה עם חרוזי ג'ל אליהם מחובר חומר עם אפיניות ספציפית לחלבון אותו נרצה למצוא. החלבונים הללו ייקשרו אל החרוזים בעוד ששאר החומרים יצאו דרך הקולונה. כדי לשחרר את החלבון המעניין אותנו מהחרוז נשטוף את הקולונה עם מולקולות שיתחרו עם אתרי קשירה של החלבון ויאפשרו לו להתנתק מהחרוזים (ביטים) ולצאת דרך הקולונה.

-דוגמה חלבון שקושרים בקצה שלהם מולקולה של גלוקוז (אנזים וסובסטראט שלו). כדי לשחרר את החלבון נשים גלוקוז מתחרה חופשי לאתר הפעיל ואז החלבון יתנתק מהאתר הפעיל ובמקומו החומר מתחרה בריכוז גבוהה יותר נקשר.
- היתרון של השיטה הזו שהיא מאוד יעילה מבחינת ניקיון.
- החיסרון הוא שיש לנו צורך בידע מוקדם על החלבון על מנת ליישם אותה.

אם לא יודעים שום דבר לגבי החלבון, האם ניתן להשתמש בכרומטוגרפית זיקה? לא

מכניסים לחלבון תג זיהוי מלאכותי. עושים מניפולציה ברצף החלבון: מכניסים רצף ח"א בעלות תכונות מיוחדות- למשל היסטידין. היסטידינים ברצף נקשרים חזק למתכות מעבר כמו ניקל. אם נכין קולונה עם חרוזי מעבר עשויים ניקל: החלבון אותו הינדסתי (ברמת הגן) ייתפס בחרוזים האלו.

לשם כך עליי לדעת את הרצף והגן של החלבון.

קולונות תחת לחץ

קולונה – מעין מבחנה שבתוכה מכניסים שרף (חלקיקים בגודל מסוים בעל חלקיקים בתכונות מסוימות).

לוקחים משאבה ממתכת חזקה מכניסים בתוכה שרף ומחברים אותה למשאבה שמייצרת לחץ גבוה ודוחפת בכוח את הנוזל בלחץ. נוצרת מערכת של רזולוציה מאוד גדולה בזכות גדלי השרף.

הקולונות עשויות שרפים בעלי כושר ספיחה מאוד גבוה. הגרגרים מאוד דחוסים. קצב המעבר כתוצאה נמוך, ולכן יש להפעיל לחץ על מנת שהחומרים יעברו.

ההפרדה נעשית ברזולוציה מאוד מאוד גבוהה, כלומר ההפרדה מאוד טובה, פחות גסה.

אחרי ביצוע מדידה:

בפועל אנחנו משתמשים בכמה שיטות שונות כדי להגיע פרקציה חלבונית שמעניינת אותנו באמת, כאשר יש בה אחוז גבוה מאוד של החלבון שלנו.
חשוב לזכור שהתמיסה שלנו המבוקשת לא תגיע אף פעם לרמת ניקיון של 100% ולכן ייתכן שיהיו עוד חלבונים ושנאבד מהחלבון שלנו קצת בדרך.

איך ניתן למדוד את אפקטיביות הפרדת החלבונים?

·       בדיקת פעילות ספציפית: מידת הניקיון בשלב מסויים היא הפעילות הספציפית באותו השלב (קצב ריאקצית החלבון המבוקש חלקי כמות החלבונים הכוללת התמיסה). ככח שיש פעילות ספציפית גבוהה יותר בסוף הניקיון כך מהווה ניקיון טוב יותר על אף ירידה בכמות החלבון שלנו.

·       אלקטרופורזה על גבי ג'ל: מתבססת על נדידת מולק' טעונות בשדה חשמלי.  מהירות הנדידה של מולק' בשדה חשמלי תלויה בעוצמת השדה, במטען המול' ובמקדם החיכוך של המדיום בו המולק' נעות.

במה תלוי מקדם החיכוך?

גדול וצורת המולק', צמיגות המדיום בו המולק' נעה.

את האלקטרופורזה בד"כ מבצעים בג'ל פורוזי. אם המדיום הוא כזה אפשר לקבל הפרדה יותר טובה בין החלבונים מאשר מדיום אחר.

הג'ל מורכב מאמבט תחתון, אמבט עליון של אנודה וקתודה. ביניהם יש 2 פלטות זכוכית דקות כשבאמצע יש ג'ל פורוזי. הג'ל הוא רשת מחוררת תלת מרחבית שאפשר לבחור את גודל החורים. על הג'ל יש מולק' בגדלים שונים. מולק' נעות דרך התווך הנקבובי במהירויות שונות. מולק' קטנות ינועו מהר ממולק' גדולות.

מה ההבדל בין אלקטרופורזה ושיטת המסננת המולקולרית (קולונות)?

בשיטת האלקטרופורזה יש לכל המולק' אותו נפח נגיש לרשותן.

בשיטת הקולונה למולק' הגדולות יש נפח נגיש קטן יותר.

איך בונים את התווך הנקבובי של אלקטרופורזה?

ריאקציות של פילמור. דוגמא לפולימר היא למשל פוליאקריל אמיד.

מה שיקבע את גודל החורים יהיה כמות הקשרים המצולבים בפולימר (הריכוז של הביסאקרליאמיד שיוצר את הקשרים הללו). חשוב: גודל החורים (הצמיגות, צפיפות, הפרעה) משנה על החיכוך וזה משנה על מהירות ובסוף משפיע על התנועה של החומר.
חשוב: מולקולה גדולה תנועה יותר לאט בגלל מבנה התווך, כלומר מקדם חיכוך גבוהה ינועו לאט יותר. מהווה הפרדה על סמך גודל.

הפרדת חלבונים הנעשית בתנאי דנטורציה SDS

משתמשים ב-SDS- דטרגנט יוני עם ראש פולרי וחלק הידרופובי. החומר הזה מעכב את הקשרים הלא קוולנטים במולק' החלבון. הוא בעצם פורש את החלבון ויש לו תכונת מטען מאוד חזקה. בעיקרון בממוצע מולק' אחת של SDS נקשרת לכל שני שיירים של חומצות אמינו. מה שקורה בעצם: החלבון פרוש וקשורות אליו המון מולק' SDS. מאחר ויש עליו הרבה מולק' כאלה שהן מאוד טעונות, המטען של החלבון עצמו נעשה זניח.

התוצאה - ככה בעצם מתייחסים רק לתכונת הגודל ולא המטען.

עוצמת הצביעה מעידה על כמות החלבון ודרגת הניקיון. אם אין פסים נוספים אז אין חלבונים נוספים.

אם ברצוננו לדעת את גודל החלבון שלנו ניתן לשים בבארית נפרדת דוגמא המכילה חלבונים בגדלים ידועים מראש. כאשר נשווה את מרחקי הנדידה של החלבונים שקיבלנו לאלו של החלבונים שאנו יודעים את גודלם נוכל לדעת את גודל של החלבונים שלנו (זאת מאחר ויש יחס ישר בין מרחק הנדידה לגודל החלבון שהרצנו)

אלקטרופורזה מאפשר לי לקבוע משקל מולקולארי של חלבון בגלל תכונת גודל. המוביליות של חלבונים היא פרופורציונאלית הפוך לרדיוס. יש יחס לינארי הפוך בין הלוגריתם של המשקל המולקולרי לבין המוביליות של החלבון בג'ל.

-       הפרדה בג'ל לפי גודל

-       הפרדה בג'ל לפי מטען

לוקחים מדיום של ג'ל. משתמשים בג'ל נטיבי- לא פוגע במבנה החלבון. הג'ל בנוי באופן כזה שיש לו גרדיאנט של pH מנמוך לגבוה. כאשר נריץ שדה חשמלי מנק' אחת לשנייה, חלבונים שונים ינועו בשדה החשמלי עד הנקודה האיזואלקטרית שלהם- הנקודה בה המולק' לא טעונה.

בנקודה הזאת השדה לא פועל עליהם ולכן הם מפסיקים לנוע.

השיטה נעשית מן הסתם ללא SDS

-       ג'ל דו מימדי

הפרדה בין החלבונים בשני מימדים: במימד האנכי יש הפרדה לפי מטען. במימד האופקי מפרידים לפי גודל.

[לראות טבלה מסכמת של כל ההפרדות במצגת]

                                קביעת רצף של חומצות אמינו

1. הדירוליזה של הפפטיד- קבלת ח"א בודדות.

2. הגבת התערובת עם ריאגנט שנקשר לכל חומצה אמינית והתכונות שלו משתנות בהתאם לחומצה שהוא נקשר אליו.

3. קולונה- בכל בופר ישתחררו חומצות אמינו אחרות. לפי הבליעה נדע איזה חומצת אמינו יש בכל אלוציה.

ככה מקבלים הרכב- היחס בין חומצות אמינו.

איך נדע את הסדר?

קביעת החומצה האמינית הראשונה: שתי דרכים:

א. ריאגנט סנג'ר: מולקולה כמו דנזיל כלוריד, דבסיל כלוריד או פלורודיניטרובנזן (FDNB): נקשרות לחומצה האמינית הראשונה בקצה N של החלבון. לאחר מכן יש צורך בהידרוליזה חזקה באמצעות 6 מולרHCl על מנת להפריד את הצמד הזה מיתר החלבון. ההידרוליזה הזו גורמת גם לפירוק של יתר הפפטיד לח"א.

ב. דגרדציית אדמן: הריאגנט שמשתמשים בו בשיטה זו הוא פניל איזו ציאנט. יוצר תצמיד עם החומצה האמינית הראשונה של החלבון. על מנת להפריד תצמיד זה מיתר החלבון ניתן להסתפק בהידרוליזה חלשה שלא מפרקת את יתר החלבון. באופן כזה ניתן לבצע את התהליך הזה מספר פעמים- כאשר כל פעם מורידים את החומצה האמינית הראשונה הבאה שנחשפת. ככה מרצפים חומצת אמינו אחת אחרי השנייה.

השיטה יעילה עבור חלבון קצר מאוד (50 ח"א)

שיטות חיתוך ספציפי של חלבון לפפטידים:

א. שימוש בחומרים כימים שמבקעים באופן ספציפי קשרים מסויימים. למשל ציאנוגןברומידCNBr: עושה חיתוך לקשר פפטידי אחרי ח"א מתיונין.

ב. חיתוך אנזימטי: אנזימים שחותכים באופן ספציפי קשר פפטידי אחרי חומצה אמינית מטיפוס מסויים.

טריפסין: חותך אחרי ליזין וארגינין

כימוטריפסין: חותך אחרי ח"א עם שייר הידרופוביים גדולים/ ארומטיים: טריפטופאן, תירוזין, פניל אלנין, לאוצין, מתיונין

הרכבת רצף החלבון השלם ע"י מפת פפטידים שיצרנו.

השיטה המקובלת היום- קיבעת רצף החלבון מתוך רצף הDNA

יחסים בין רצפים

ידיעת רצף נותנת הרבה מידע על פעילות החלבון.

מראה קשר בין רצף של המוגלובין ורצף של מיוגלובין.

עושים השוואת רצפים ובודקים כמה הם דומים. הדימיון הזה מראה על קשר בין החלבונים. במקרה הזה הדמיון ברצף מעיד על דמיון במבנה.

כשמסתכלים על המבנים של המוגלובין והמיוגלובין רואים מבנה תלת מרחבי פחות או יותר דומה.

קביעת המבנה התלת מרחבי של החלבון

ישנן כמה שיטות לעשות זאת:

1. קריסטלוגרפיית קרני X:

ניתן להקרין קרני X על פני מולקולה מגובשת של חלבון. הגביש יגרום לפיזור של הקרניים האלו, אשר יגיעו אל הדקטור המקיף את המולקולה. הדקטור ייתרגם את הפיזור לתמונה של צפיפות אלקטרונים, ומכאן ניתן להסיק אילו אטומים מונחים באיזה מקום במרחב.

2. NMR- nuclear magnetic resonance: לאטומים יש ספין אלפא וביתא. ברגע שמקרינים עליהם גלים אלקטרומגנטים הספין שלהן משתנה. ניתן למדוד את השינוי הזה וליצור באופן כזה תמונה של מבנה מרחבי, אם כי ברזולוציה נמוכה מזו של קריסטלוגרפית קרני X.

ספקטרומטרית מסות:

מספק- מכשיר לעזור לנו לקבוע מסת חלבון.

קרן שמוקרנת על החלבון גורמת לו לעבור יוניזציה. אח"כ החלבונים מואצים דרך שדה חשמלי. ככל שחלבון גדול יותר התאוצה שלו תהיה קטנה יותר. חלבונים קטנים יגיעו לדקטור ראשונים. יש קרן לייזר שמתזמנת את משך הזמן שלקח לחלבון להגיע לדקטור ומתרגמת מתוך נתון זה את מסת החלבון.

Western blot- דרך לבצע זיהוי חלבונים על גבי ג'ל בצורה רגישה יותר באמצעות נוגדנים. חלבון שנקשר לנוגדן מסויים ייקשר אליו וככה ייקשר לג'ל ויתר החלבונים יישטפו.

שיעור 4: אנזימים- מושגים כלליים וקינטיקה

בשיעור זה נלמד על ריאקציות בתוך התא בעיסוק בקינטיקה אנזימטית. כל הריאקציות הדרושות לתא לצורך קיומו הן הודות לקיומם של האנזימים.

אנזים - מארקומולקולות ביולוגיות הנוצרת בתא חי, בעיקרון הוא חלבון המזרזת באופן קטליטי (מחזורי) ריאקציות ספציפיות במערכת בתנאים מתונים. פעילותו נעמדת לבקרה.
קטליטי – מחזורי – תהליך שחוזר על עצמו שוב ושוב באופן מחזורי.
תנאים מתונים – כל חלבון יש תנאי הישרדות משלו בתנאי טמ"פ, PH  וכ'ו שונים.

רוב האנזימים הם בעצם חלבונים עם מבנה מוגדר ופעילות מאוד מוגדרת. ישנן מולק' רנ"א שגם כן מסוגלות לקטלז ריאקציות אנזימטיות. יכול להיות שהן היו המולק' הראשונות שזירזו תגובות.

יש להם מסלול מטבולי כמו הידרוליזה ולכן אם נסתכל על תא או רקמה קשה לעקוב אחרי חלבון בודד הכמות חלבונים והפעילות עצומה ולכן צריך לבודד.
- יכול להיות שבאופן פיסיקלי הדברים היו קורים לבד אבל האנזים הוא מזרז שיקרה מהר יותר.
אנזימים מזרזים ריאקציות לקצב של פי כמה סדרי גודל- 10 בשישית, 10 בשביעית, 10 ב-17(!!)...
- אנזים שעובד ללא בקרה ומשתולל הוא גורם לנזקים יציאה משליטה וגרימה למחלות.
-מזרזים את הריאקציות בתנאים נתונים- לא בכל תנאי קיים.
-אנזים מוציא לפועל ריאקציות בתנאים שהם נורמאליים לחיים.

חיתוך פפטיד ע"י אנזים:
- טריפסין סוג של פפטידאז חותך בצד הקרבוקסילי של ליזין וארגנין.
- טרומבין פרוטאז חותך בצד הקרבוקסילי של ארגנין.
-

Kcat- קבוע קטליטי. ספציפי לכל אנזים.

ריאקציה של שבירת קשר פפטידי:
הריאקציה הזו מקוטלזת ע"י פפטידאזות.
אנזים הטריפסין שובר קשר פפטידי באופן ספיציפי רק אחרי שיירים של ליזין וארגינין. כלומר משהו באנזים הזה מכיר קשר פפטידי רק כשהחומצה שלפניו היא ליזין או ארגנין.

- פרוטאז חותך בצד הקרבוקסילי של ארגנין.

כלומר יש ספציפיות רבה בין האנזים לסובסטרט שלו. לפעמים יש אנזימים שעובדים על טווח של סובסטרטים (פחות ספציפים). בשיעור הזה ואלה שאחריו נדבר בעיקר על ספציפיות גבוהה. מקור הספציפיות היא בהתאמה תלת מרחבית בין האנזים לסובסטרט, ואינטראקציות לא קוולנטיות בין השייר של האנזים לסובסטרט.
פעילותו של אנזים היא נתונה לבקרה. הבקרה הזו נעשית ע"י מעכבים/ משפעלים.

אנזימים נדרשים לצורך פעילותם בהרבה מקרים לקו פקטורים- מולק' כימית קטנה שאינה חומצה אמינית שנדרשת לפעילותו של החלבון.

דוג' לקו-פקטור:

·       ישנה ריאקצית ח"ח במסלול גליקולזה: פירובט עוברת חיזור ללקטט. הריאקציה יוצאת לפועל ע"י אנזים לקטט הידרוגנאז. הקו-פקטור שנדרש במקרה זה נקרא NADH. במהלך הריאקציה הקו- פקטור הזה הופך לNAD+.

סוגי קו-פקטורים:

1.     קו אנזימים: מולק' אורגניות קטנות. לרוב נגזרות של ויטמינים

2.     מתכות: אבץ, מגנזיום, ניקל....

הולואנזים- אנזים עם קו פקטור

אפואנזים- אנזים בלי קופקטור

קבוצה פרוסטטית- קו פקטור שנקשר כ"כ חזק לאנזים שהוא לעולם ל עוזב אותו.

קבוצות פרוסטטיות עוזבות את האנזים רק אם הוא עובר דנטורציה.

איך מושגת הספציפיות של אנזימים?
מבנה מרחבי שקובע אזור בחלבון אתר פעיל אתר קישור שידע ליצור את מקסימום האינטרקציות האלטרו סטטיות הידרופוביות קשרי מימן וכ'ו
הספציפיות הזו נובעת מהמבנה התלת מימדי של החלבון שנובע מהרצף כמובן.

כיצד אנזימים עובדים?

מורידים את המחסום האנרגטי של ריאקציה כימית.

למעשה כל ריאקציה כימית בין מגיבים לתוצרים יש מחסום אנרגטי. נדרשת אנרגיה אקטיבציה. האנזימים מורידים את המחסום האנרגטי מערך גבוה לערך נמוך--> מעלה את הסיכוי של המגיבים להפוך לתוצרים.

האנזימים לא משנים את השווי משקל של הריאקציה, אלא רק מזרזים את ההגעה אליו.

מה שקובע אם ריאקציה מתרחשת הוא דלתא G בין מגיבים לתוצרים סופיים.

מאחר ותוצר הביניים נמצא במקום של דלתא G חיובי התגובה נתקלת במחסום אנרגטי.

הצורון של מצב המעבר הוא מאוד מעורער מבחינה אנרגטית- בעל אנרגיה מאוד גבוהה.

האנזים בעצם מקטין את המחסום האנרגטי. הוא גורם לכך שצורון הביניים יהיה בעל אנרגיה חופשית נמוכה יותר.

ככל שהמחסום קטן יותר קל יותר ליותר מולקולות לעבור אותו ולכן הריאקציה תתרחש מהר יותר.

האנזים מזרז את הריאקציה בשני הכיוונים באותה המידה- כלומר גם לתוצרים יותר קל להפוך חזרה למגיבים.

לכן, האנזים לא משנה את שיווי משקל- ז"א את היחס שנשמר בין כמויות המגיבים לתוצרים.

מה  שקובע את היחס בין התוצרים הסופיים למגיבים ההתחלתיים הוא דלתא G  כולל בלבד.

גליקוליזה: הפיכת גלוקוז ל-ATP.

יש מעבר מקטון לאדלהיד. קבוצה קרבונילית משנה מקום. יש אנזים ספציפי לריאקציה הזו טרי פוספו-איזומראז. הריאקציה הזו תתרחש רק לפי קריטריון ספונטניות שנקבע ע"י דלתא G.

דלתא G נקבע לפי אופי החומרים המשתתפים ולפי ריכוזם. במצב ש"מ דלתא G הוא 0. [לראות נוסחאות במצגת].

כלומר, אם נשנה את ריכוזי החומרים ניתן לגרום לריאקציה להתרחש.

לריאקציות הרבה פעמים יש פוטנציאל התרחשות (אנרגית תוצרים נמוכה מזו של המגיבים) אבל הן לא מתרחשות. מדוע?? מחסום אנרגטי מאוד גבוה. ז"א יש כאן בקרה קינטית של א. שפעול מאוד גבוהה.

מה החשיבות בזירוז תגובות???

מאפשר לתהליכים למצות את הפוטנציאל התרמו דינמי שלהם ע"י עקיפה של בקרה קינטית.

מה מנגנון הפעולה של האנזימים??

האנזים עובר אינטראקציה עם הסובסטרט שלו, כלומר נקשר אליו באתר הפעיל שלו. האתר הפעיל הזה עבר אבולוציה לקשור טוב יותר את צורון מצב המעבר. קישור זה גורם לייצוב אנרגטי של הצורון.

עדויות לקשירת אנזים סובסטרט:

1.     תצפיות ניסיוניות: ריאקציות המזורזות ע"י אנזימים הרבה פעמים מגיעות לרוויה. גרף אופייני לריאקציה מזורזת- ראה במצגת. מהירות הריאקציה כפונקציה של ריכוז הסובסטרט: ככל שיש יותר סובסטרטס; המהירות עולה בצורה מאטה עד שמגיעה לנקודה קבועה- מהירות מקסימלית שאותה אי אפשר לעבור. ההסבר לגרף הזה הוא קישור אנזים סובסטרט.

2.     זיהוי אתרים פעילים באנזים באמצעות קריסטלוגרפית קרני X.

3.     שינוי בתכונות הספקטרוסקופיות של אנזימים עם קישור סובסטרט. כאשר האנזים קושר סובסטרט יש שינוי בספקטרום הפלורסינציה. זה מעיד על שינוי המבנה של האנזים עם הקישור.

זוהי אינדיקציה ראשונית שאומרת שקטליזה אנזימטית מתרחשת ע"י קישור אנזים סובסטרט.

האתר הפעיל: אתר בנמצא בכיס/ בקע בתוך החלבון. יש לאתרים פעילים של אנזימים מספר תכונות משותפות:

·       מורכב משיירים צידיים של ח"א הרחוקות זו מזו ברצף.

·       האתר הפעיל תופס חלק קטן מנפח החלבון. מס' מצומצם של ח"א מעורבות ביצירת האתר הפעיל. מבנה החלבון כולו עם יתר ח"א מהווה שלד להרכבת מבנה האתר הפעיל.

שיירי האתר הפעיל הרבה פעמים ממוקמים בלולאות, לופים.

·       האתר הפעיל בחלבון הוא מיקרו סביבה ייחודית. למשל הרבה פעמים באתר הפעיל אין מים. הם מייצרים מיקרו סביבה נוחה לקטליזה.

·       סובסטרטים נקשרים לאנזימים באמצעות מאסף אינטראקציות לא קוולנטיות חלשות. מאסף האינטראקציות הזה מגדיר את הספציפיות של האנזים שנקשר ספציפית לסובסטרט הזה.

·       הספציפיות של אנזימים נובעת מסידור תלת מרחבי מדוייק של האטומים באתר הפעיל. הסידור הזה מתאים לקישור הסובסטרט.

ישנם שני מנגנונים אפשריים לתיאור הקישור של האנזים לסובסטרט שלו:

-       התאמת מנעול מפתח: התאמה מרחבית מושלמת.

-       התאמה מושרית: מבנה האתר הפעיל לא מתאים לחלוטין לסובסטרט. רק כאשר הסובסטרט מתחיל להתקרב החלבון מתאים עצמו לסובסטרט.

כל אלמנט סביבתי שמשפיע לי על הצורה של החלבון גורר אחריו אובדן פעילות של האנזים. הפעילות של האנזים מאוד מושפעת מהמבנה.

אובדן מבנה-> אובדן פעילות.

יש חלבונים שמטרתם להציל אנזימים שאיבדו את המבנה המרחבי שלהם- עוזרים להם להתקפל.

נתאר את פעילות האנזים בצורה כמותית:

קינטיקה אנזימטית:

[מראה גרף שבודק את קצב הריאקציה כפונקציה של ריכוז סובסטרט]

יש גרף עולה באופן שהולך ומאט, עד שמגיעים לקצב מקסימלי.

הגרף נחלק ל-3 איזורים:

אזור 1- עלייה לינארית (סדר ראשון)

אזור 2- עלייה הולכת ומאטה (סדר בין 0 ל-1)

אזור 3- קו אופקי (סדר 0)

מטרתנו להציע מנגנון שמסביר התנהגות איכותית כזאת של אנזימים רבים.

ואז באו כמובן- מיכאליס מנטן

E + S ßà ESà P + E

ES- קומפלקס אנזים סובסטרט.

ראה גרף ריאקציה במצגת.

במודל שמיכאליס מנטן מציעים יש כמה הנחות חשובות:

·       עובדים תחת תנאים שבהם התוצר P לא מתפרק חזרה. אם התוצר מצטבר יהיה חץ שהולך אחורה חזרה לES. המטרה היא שהחץ ילך רק בכיוון P. התוצר נוצר וכמעט הוא לא מתפרק חזרה, כלומר הריאקציה יצירת התוצר הוא לא ראקציית שווי משקל.

·       הנחת מצע עמיד לגבי ES. הניחו שקצב היצירה והפירוק שלו שווים, ריאקציה שיווי משקל.

KM מהווה למדד אפיניות (זיקה) של האנזים לסובסטראט שלו. נגזר מייחוס של קבועי הקצב. KM נמוך משמעו אפיניות גבוהה.
KM הוא ריכוז הסובסטראט שבו מושגת מחצית מריכוז מקסימלית של האנזים.

מהירות מקסימלית קבוע מאפיין של אנזים מייצג באופן תאורתי את המהירות המקסימלית אליה יוכל להגיע האנזים במצב שבו כל האנזימים מחוברים לסובסטראט.

קבוע קטליזה KCAT הוא מדד להערכת מספר מחזורי האנזים, כלומר כמה פעמים בשנייה אחת מזרז האנזים ראקציה.

V=dP/dt

קצב הריאקציה הוא השתנות ריכוז התוצר עם הזמן.

בתחילת הריאקציה יש מהירות תחילית תחת תנאים שהתוצר עדיין לא הצטבר.

בדקו מהירויות תחיליות של ריאקציה כל פעם עם ריכוז התחלתי של סובסטרט שונה. ככל שריכוז התחלתי של סובסטרט גבוה יותר המהירות התחילית גבוהה יותר.

V₀=(V_max*[S])/(K_m+[S])

בריכוזי סובסטרט קטנים: לא כל מולק' האנזים פועלות. ככל שריכוז סובסטרט עולה יש להן יותר סיכוי לפגוש מולקולות אנזים- קצב מתגבר. כאשר ריכוז הסובסטרט מאוד גבוה מה שמגביל את קצב הריאקציה הוא מס' מולק' האנזים. כולן בתפוסה מלאה ולכן עם הגדלת ריכוז הסובסטרט לא תהיה הגדלה של המהירות.

[מראה פיתוח של המשוואות]

V_max=K₂*E₀

Km הוא קבוע אופייני לאנזים. זהו קבוע שהוא בדיוק ריכוז הסובסטרט שנותן את חצי המהירות המקסימלית. (להציבKm במקום S במשוואה)

ככל ש-Km יותר קטן, צריך פחות ריכוז סובסטרט בשביל להגיע למהירות מקסימלית- ז"א האפיניות של האנזים לסובסטרט גדולה יותר.

Km נמוך--> אפיניות גבוהה.

K_m= (K₂ + K_-1)/K₁

Vmax- המהירות המקסימלית שניתן לקבל בריכוזי סובסטרט מאוד גבוהים. זהו ערך קבוע לכל אנזים.

K_cat=K₂

זהו מספר המחזורים שהאנזים מבצע בשניה.

Kcat/Km: מדד ליעילות הקטליטית של אנזים. יעילות קטליטית של אנזים נמדדת עבור ריכוזי סובסטרט נמוכה. כאשר נציב במשוואה ריכוז סובסטרט נמוך, כלומר זניח, נקבל את המשוואה:

V= (Kcat/Km)* Et*[S]

בעצם הקבוע האפקטיבי כאן הוא kcat/km והוא המדד ליעילות האנזים.

<<מראה מניפולציה לינארית על המשוואה של מיכאליס מנטן>>

עיכוב פעילות אנזימים מיכאליאנים (שפועלים לפי מיאכליס מנטן)

 נתמקד בשני סוגי מעכבים:

1.     מעכב תחרותי- מתחרה על האתר הפעיל של הסובסטרט על גבי האנזים.

2.     מעכב לא תחרותי- נקשר במקום אחר באנזים ולא באתר הפעיל

עיכוב תחרותי:

האנזים יכול לקשור או את המעכב או את הסובסטרט.

מראה גרפים משוואות נוראאא כיפיים שכאלה...

אם נגדיל את ריכוז הסובסטרט נתגבר על העיכוב התחרותי- משום שיהיה יותר סיכוי לקשור סובסטרט מאשר מעכב.

Km(app)=Km(1+I/K_I

מוריד אפיניות אנזים סובסטרט

עיכוב לא תחרותי:

יכול להיווצר קומפלקס אנזים+מעכב+סובסטרט. הקומפלקס הזה לא פעיל.

פה, בניגוד למקרה הקודם, הגדלת ריכוז הסובסטרט לא יכולה לעקוף את העיכוב.

יש מעכבים הפיכים ובלתי הפיכים.

בד"כ מעכב בלתי הפיך יוצר קשר קוולנטי עם האנזים.

שיעור 5- מנגנוני קטליזה

דיברנו על קטליזה אנזימטית והוא לא אומר לנו איך הוא עושה את זה מי משתתף בתהליך איזה ראקציה הוא מקדם איזה מולקולות משתתפות איזה שיירים יש איזה מנגנון קטליטי יש בתהליך. בקיצור לומדים איך הוא עובד.

אז כיצד אנזים מוריד את אנרגיית השפעול?

K₂=Kcat- מייצג כמה מחזורים בשנייה האנזים עושה.

האנזים מוריד את א. האקטיבציה וזה מתחיל מקישור של סובסטרט לאנזים. אינטראקציות לא קוולנטיות אחראיות לקישור הזה. הקישור הוא האופטימלי ביותר במצב המעבר.

האנזים והסובסטראט בסוף שניהם עושים איזשהי התאמה כדי שהם יוכלו להיות מותאמים אחד לשני כחתן וכלה.

אנרגית קישור:

-       קובעת ספציפיות

-       מגדילה את היעילות הקטליטית. (מעודדת גיאומטריה אופטימלית)

-       מזרזת שינויים קונפורמציונאליים.

זוהי האנרגיה המשתחררת כתוצאה מיצירת אינטראקציות לא קוולנטיות חלשות בין האנזים לסובסטרט שלו.

אנרגית הקשר מנוצלת לסידור מחדש של האנזים ביחס לסובסטרט כדי להשיג גיאומטריה אופטימלית.

אסטרטגיות קטליזה

חשוב לצורך הבנת יחסים אבולוציוניים בין משפחות חלבונים מסוימות.
ניתן לחלק ל-4 קבוצות שונות של תהליכים בהם אנזימים משתמשים לקידום ראקציה.

ישנן 4 אסטרטגיות עיקריות:

1. קטליזה קוולנטית - קשר קוולנטי רגעי בין אנזים לסובסטרט. קישור רגעי קצר וחולף והפיך כדי לייצב מצב מעבר ולהתקדם עם הראקציה.

2. קטליזת חומצה בסיס - שימוש בבסיסים וחומצות כלליים שמשמשים כמקבלי או תרומי פרוטונים.

3. קטליזה בעזרת יוני מתכת – יון מתכת משמש כקופקטור עזר לקידום ראקציות. היונים הם בעלי אופי חיובי. משמשים כמייצבים של מטען שלילי, יכולים להיות זרזים ליצירת נוקלאופילים חזקים, תורמים לאנרגית הקישור של הסובסטרט לאנזים.

4. באמצעות קירבה - האנזים מביאים את שני הסובסטרט לידי קרבה מרחבית בגיאומטריה - באוריינטציה מסוימת ונכונה. גורם לזירוז הקטליזה הספציפית.

-בכל הדוגמאות הללו שיירים באתר הפעיל באנזים מעורבים בקשירה ושבירה של קשרים.
-פוטנציאל אינטראקציה מלא קיים במצב המעבר. סובסטראט נקשר לאתר הפעיל של האנזים עי אינטראקציות קוולנטיות רבות. רק במצב מעבר קיים אינטראקציה מלאה.
- אנרגיית קישור גבוהה סימן שהוא נמצא במצב מעבר טוב וזה מאפשר מעבר לשלב הבא.
- אנרגיית קישור גבוהה מבטא התאמה בין אנזים לסובסטראט.
- מזרז התאמה וריאקציה.

כימוטריפיסין: שובר קשרים פפטידיים, אמידיים. חותך אחריי חומצות אמינו ארומטיות גדולות בצד הקרבוקסילי. זה האנזים המרכזי שנדבר עליו היום.מייצג אסטרטגיה של קטליזה קוולנטית.

הוא פרוטאז (ממשפחת הפרוטאזות) - חותך קשרים פפטידיים בצורה ספציפית (אחרי שיירים ארומטיים גדולים או הידרופוביים גדולים).

הצורך בפרוטאוליטים הוא גדול מאוד. לחלבונים יש זמני מחצית חיים- הם נוצרים ומתפרקים. כאשר הם מתפרקים צריך למחזר את הרכיבים שלו.

לכימוטרפיסין יש נוקלאופיל מאוד חזק באתר הפעיל שתוקף אטום קרבונילי של סובסטרט. באופן כזה נוצר קשר קוולנטי רגעי. שייר סרין הוא הנוקלאופיל החזק, ולכן הוא נקרא "סרין פרוטאזה"

צריך לזרז שבירה של קשר פפטידי. הריאקציה של השבירה עדיפה מבחינה תרמודינמית. אבל המגיבים מאוד יציבים (קשר פפטידי רזונטיבי- מאוד מאוד חזק- הרזוננס מקנה לו אופי של קשר כפול) ולכן בפועל הריאקציה לא מתרחשת ללא אנזים.

האנזים עוזר למצות את הפוטנציאל התרמודינמי של הריאקציה הזו. מוריד את המחסום האנרגטי הגדול שמקורו בייצוב קינטי ע"י הקשר הפפטידי.             

בתוך האתר הפעיל יש שלושה חומצות אמיניות חשובות מאוד ואחת מהן היא סרין (הרי כימוטרפסין ממשפחת הסרין פרוטאזות).

איך ניתן ללמוד על פעילות הקטליטית של האנזים כימוטרפסין?

1. באמצעות אנליזה של קינטיקת מצב עמיד: ממנה ניתן ללמוד על Km, Kcat. זו אנליזה שבודקת קצב ריאקציה כפונקציה של ריכוזי סובסטרט.

הבעיה- לא ניתן ללמוד מכאן על המכניזם עצמו.

2. אנליזה של קינטיקה לאורך זמן: מראה לנו את קצב הריאקציה כפונקציה של הזמן. מכאן ניתן ללמוד על קבועי קצב בשלבי הריאקציה השונים, כלומר ככה ניתן כבר ללמוד על המכניזם עצמו.

3. אפשר ללמוד על כימוטריפסין גם לפי פענוח המבנה: למצוא אתרים פעילים, קב' ריאקטיביות שמסייעות לקטליזה.

כיצד נדע לזהות שיירים קטליטיים חשובים באתר הפעיל?

ניתן להשתמש במעכבים שאינם הפיכים כדי לנסות למפות את האתר הפעיל. זה בעצם הדבר הראשון שעשו עם הכימוטריפסין.

יש 3 מעכבי בלתי הפיכים:

·       Group specific chemical…: ריאגנטים כימים בעלי תכונות ספציפיות - רגנטים שעושים התמרה כימית ספציפית לקב' ריאקטיביות באנזימים.

·       Affinity labels: מולק' קטנות שדומות לסובסטרט ומוכרות באופן ספציפי באתר הפעיל. קישורם מונע מהאנזים לבצע את הקטליזה שלו.

·       מעכבים "התאבדותיים"- דומים לסובסטרט, מתערבים בשלבים ספציפיים במסלול הקטליזה.

מפושט:

בהתחלה משתמשים בדברים הכי פשוטים. קודם מנסים לזהות את השיירים הריאקטיביים בחלבון מתוך הנחה שהם אלה המעורבים בקטליזה.

שלבי האנליזה:

לקחו ריאגנט group specific שנקרא DIPF: מגיב ספציפית עם שיירי סרין. יוצר קשר קוולנטי עם הקב' בסרין- גורם לנטרול האנזים. מכאן הבינו שסרין 195 היא ח"א חשובה לקטליזה.

הח"א הזו נמצאת באתר הפעיל.

ריאגנטים של אפיניות: המבנה שלהם דומה לסובסטרט ונקשרים באתר הפעיל של האנזים.

לקחו ריאגנט כזה. הוא נקשר לאתר הפעיל ויצר אינטראקציה עם שייר היסטידין שנמצא בתוכו.

האנזים כתוצאה נוטרל מפעילותו. מכאן זיהו שבאתר הפעיל מעורב שייר היסטידין. (היסטידין 157).

<<זהו ההיסטידין שמשמש כקטליסט חומצה בסיס>>

בדיקת קינטיקה שלפני מצב עמיד:

מודדים את התקדמות הריאקציות לאורך זמן במילי שניות.

אנליזה של זרימה מופסקת: יש מתקן ובו שני מזרקים. אחד אנזים (כימוטריפיסיו) שני סובסטרט. אם אני מאפשר להם לזרום דרך המזרקים הם יתערבבו ותתחיל הריאקציה.

המעקב אחר ההתקדמות הוא באמצעות שיטות ספקטרוסקופיות.

אפשר להפסיק את הזרימה ע"י מזרק שלישי.

ככה אפשר לעקוב אחרי הריאקציה בטווחי זמן מאוד קצרים.

הסובסטרטים שבהם משתמשים הם אנלוגיים של סובסטרט בעלי תכונות כרומוגניות.

כשקשר עובר הידרוליזה נוצרת תרכובת שיש לה בליעה מסויימת. אפשר לעקוב אחר מידת הצבע כמדד להתקדמות הריאקציה.

קיבלנו גרף ציר X זמן במילישניות אחרי הערבוב, ציר Y בליעה.

לריאקציה יש שתי פאזות:

פאזה מהירה שקצב ההצטברות של התוצר הוא לינארי עם שיפוע מאוד גדול. (burst phase). אח"כ יש פאזה מאוד איטית- עם שיפוע כמעט אפסי.

כל פאזה מייצגת תהליך מסויים בקינטיקה של פעולת האנזים.

הפאזה הראשונה היא pre-steady state והשניה היא steady state.

ההתנהגות הבי-פאזית מייצגת שני שלבים קריטיים עקרוניים בפעילותו של האנזים.

שלב 1: אנזים מכיר בסובסטרט. נוצר חומר ביניים (acyl enzyme)שבו חלק מהסובסטרט (אצילי) קשור לשייר הריאקטיבי באופן הקוולנטי. זה השלב המהיר. בשלב זה הסובסטרט נשבר לשניים ומשתחרר החלק האמיני של החלבון.

שלב 2: הידרוליזה של אציל אנזים: חומר הביניים עובר דה- אסילציה לקבלת האנזים + החלק השני של הסובסטרט (החלק הקרבוקסילי של החלבון)

השגת מבנה תלת מרחבי:

·       מאשר ממצאים קודמים

·       מוסיף מידע

·       מציע היפותזות חדשות

גילו שלכימורטיפסין יש מבנה רביעוני שמורכב מ-3 תת יחידות.

ראו שבתאר הפעיל יש סרין 195 והיסטידין 57. רואים חומצה אספרטית 102.

אלה 3 חומצות קריטיות בקטליזה. זו השלשה הקטליטית.

כשמסתכלים על השלשה הזו רואים כמה דברים:

סרין, לידה היסטידין, ולידה חומצה אספרטית. הגיאומטריה בין השיירים הללו מיוצבים על ידי קשרי מימן.

הארגון הזה של השלשה הקטליטית מוביל לקטליזה יעילה.

גיאומטריה תלת מרחבית שמביאה 3 שיירים קריטיים בגיאומטריה מסויימת לבצע כימיה על סובסטרטים קיימת גם באנזימים נוספים. מנגנון אבלוציוני שקיים בסרין פרוטאזות?

כשמגיע סובסטרט לאתר הפעיל איך היחס בינו לבין השלשה הוא כזה שמעודד את הכימיה?

כאשר הסובסטרט מגיע לאתר הפעיל מה שקורה למעשה זה ששייר ההיסטידין קוטף את הפרוטון של הסרין ובעצם משמש כקטליסט חומצה בסיס. כתוצאה קבוצה ה-OH של הסרין הופכת להיות O^-. זו קב' נוקלאופילית מאוד חזקה. ככה היא בעצם מאוד ריאקטיבית.

החומצה האספרטית היא חומצה טעונה שלילית. היא מייצבת את המטען החיובי שמתפתח על קב' האימידאזול כתוצאה מקטיפת הפרוטון.

נסתכל על המנגנון תוך התייחסות למה שקורה בשלשה הקטליטית:

שלב 1: הסובסטרט נקשר באתר הפעיל. האתר הפעיל הוא מצד אחד מכיל חלק של אתר קישור, ומצד שני חלק ממנו הוא הארגון של השלשה הקטליטית.

שלב 2: שלב שבו קבוצת הסרין הריאקטיבית תוקפת את אטם הפחמן שאליו קשורה הקבוצה הקרבוקסילית. זו התקפה נוקלאופילית. ההתקפה קורית תו"כ מעבר של פרוטון לקב' ההיסטידין.

נוצר תוצר ביניים טטראהדרלי מאוד לא יציב בו אטום החמצן קשור קוולנטית לקב' הפחמנית. יש על התוצר הזה מטען שלילי שמיוצב ע"י חור אוקסי אניוני שנמצא באנזים.

(לראות ציור במצגת).

החור האוקסיאניוני: המטען השלילי שמתפתח על החמצן מיוצב ע"י קשרי מימן עם שיירים נוספים שנמצאים בחור האוקסיאניוני על האנזים.

שלב 3: תוצר ביניים לא יציב מתפרק לשניים: מקבלים אציל אנזים- אנזים שקשור קוולנטית: חמצן של סרין שקשור לפחמן השייך לקצה הקרובוקסילי. הדבר השני שמקבלים הוא החלק האמיני של האנזים שמשתחרר. הקצה האמידי משתחרר בגלל אי יציבות.

שלב 4: הידרוליזה של האציל אנזים- בעצם היפרדות של האנזים מהחלק הקרבוקסילי של החלבון. כיצד?

מולקולת מים נקשרת באתר הפעיל. נוכחותה משמשת כנוקלאופיל להידרוליזה של האציל אנזים.

ההיסטידין משמש כקטליסט חומצה בסיס כדי להפוך את קבוצה OH לריאקטיבית על מנת שתשמש כנוקלאופיל. הנוקלאופיל תוקף את הקשר בין הפחמן הקרבוקסילי לחמצן של הסרין.

מה קובע ספציפיות של כימוטריפסין?

חותך קשרים פפטידיים אחרי שיירים ארומטיים  או שיירים הידרופוביים גדולים.

באתר הקישור יש כיס ספציפיות שמכיר ספציפית שיירים ארומטיים גדולים. השיירים שנמצאים בכיס הזה מאפשרים מקום לשייר ארומטי גדול. יש שמה הרבה ח"א בעלות אופי הידרופובי.

ברגע שהסובסטרט נקשר ספציפית לכיס, לא רק הספציפיות מוכתבת אלא גם הקשר הפפטידי מתמקם בגיאומטריה נכונה ביחס לשלשה הקטליטית.

משפחת סרין פרוטאזות

יש הרבה סרין פרוטאזות (לכולם יש סרין בשלשה הקטליטית).

יש להם רצף דומה, מבנה תלת מרחבי דומה, שלשה דומה... אבל הספציפיות היא שונה.

מה מסביר את הספציפיות???

כיס הספציפיות הוא שונה. לכימוטריפיסין יש כיס ספציפיות מאוד גדול. בבסיס שלו יש חומצה אספרטית טעונה שלילית. לכן יש העדפה לח"א ארוכות טעונות חיובית (כמו ליזין וארגנין)

באלסטז יש כיס הרבה יותר קטן שחסום ע"י ח"א הידרופוביות מסועפות. באופן מעשי מקטינות את גודל הכיס. לכן האנזים הזה חותך אחרי ח"א קטנות.

ההבדל הוא בכיסי ספציפיות. המנגנון הקטליטי הוא אותו המנגנון.

הארגון של השלשה הקטליטית כפי שקיים בסרין פרוטאזות מסויימות  קיים גם בסרין פרוטאזות עם מבנה מרחבי שונה.

מבנים תלת מרחביים שונים עברו אבולוציה מתכנסת כדי ליצור דומה מבחינת שלשה.

אותו אתר פעיל מתקבל מצורות תלת מרחביות שונות.

כיצד נזהה שיירים חשובים באתר הפעיל?

ע"י התמרת שיירים ולראות השפעה על פעילות.

אם נעשה מוטציה מכוונת ונבדוק את הקבוע הקטליטי ונעשה השוואה בין חלבון בלי מוטציה לכזה שעם מוטציה:

נראה ירידה של כמה סדרי גודל אם נעשה מוטציה לסרין, היסטידין וחומצה אספרטית.

לא כל הפרוטאזות הן סרין פרוטאזות

יש כאלה שמבוססות על ציסטאין, וח"א אחרות.

אותה אסטרטגיה, אבל נוקלאופילים שונים.

אסטרטגית קטליזה באמצעות יוני מתכת

מתכות הן בד"כ מאוד ריאקטיביות ומסוגלות ליצור קשרים מאוד חזקים. מגדילות את אנרגית הקישור. מסוגלות לייצב מטען שלילי. מזרזות יצירת נוקלאופילים מאוד חזקים.

העובדה שמתכות יכולות לקשור קב' מסויימות הופכת אותן לאלקטרופילים מאוד חזקים.

לכן מתכות משחקות תפקיד מאוד חשוב בפעילותם של הרבה אנזימים.

קרבוניק אן הידראז:

 מזרז ריאקצית סי או 2 ומים שנותנים משהו.

מזרז את הריאקציה פי מיליון.

איך זה קורה?

המבנה שלו:

באזור האתר הפעיל יש אטום אבץ שקשור ל-3 קבוצות היסטידיניות ולמולק' מים אחת. סה"כ קשור ל-4 קבוצות.

בדקו את תלות קבוע קטליטי ב-pH: ראו שפעילות האנזים גדולה יותר ב-pH בסיסי. גורם לנו להבין שבעצם מי שמשחק תפקיד חשוב כנוקלאופיל הוא המים.

האינטראקציה של האבץ עם המים גורמת לכך שנוצר OH הקשור לאבץ (פרוטון יוצא החוצה) וזה נוקלאופיל מאוד חזק. במצב זה ה-OH מאוד פעיל.

האבץ משפעל את מולק' המים כנוקלאופיל מאוד חזק שתוקף את מול' CO₂ באתר הפעיל שלה.בשלב הבא משתחררת לקבלת HCO₃-

במנגנון הזה לאבץ יש תפקיד חשוב בקטליזה- במקרה זה זירוז יצירת נוקלאופיל מאוד חזק.

1. אבץ מזרז דה פרוטוונציה של המים

2. קישור סי או 2 באתר הפעיל

3. התקפה נוקלאופילית של OH על הפחמן

4. שחרור של יון קרבונט תו"כ שחרור מולק' מים.

קטליזה ע"י קירוב

NMP kinase: מוסיף לסובסטרט קב' פוספט. מעביר קבוצת PO₃ ממולק ATP לנוקלאוטיד מונו פוספט. מעביר קבוצה פוספט מדונור לאקספטור.

האתגר בריאקציה הזו היא להעביר את הפוספט מצורה לצורה.

צריך למנוע מעבר של קבוצת Pi לתמיסה, אלא שתעבור לנוקלאוטיד.

הריאקציה קורית בסדר הבא:

1. האנזים קושר ATP

2. האנזים קושר NMP

עכשיו הוא קשור לשניהם.

3. מתחילה הכימיה: העברת פופסט מ-ATP ל-NMP

4. שחרור.

יש סדר פעולה של דברים ordered sequential mechanism

במקרה זה הסובסטרט של NMP קינאז הוא לא ATP אלא מגנזיום ATP. המגנזים מגדיל את אנרגית הקישור לאנזים ומייצב חלק מהמטען השלילי שקיים על הפופסטים על ה-ATP. בנוסף הוא מחזיק את הנוקלואוטיד בקונפורמציה מאוד מוגדרת שמאוד טובה לקטליזה.

NMP קינאז 1: אדנילט קינאז.

יש לו מבנה אלפא ביתא. בליבה יש סלילי אלפא. יש לופ מאוד חשוב שנקרא פי-לופ- קושר ומייצב פופסט. יש אזור שראה כמו מכסה.

מה קורה בריאקציה???

1. קישור ATP: כאשר הוא נקשר יש שינוי קונפורמציה. הלופ עוטף את הATP והמכסה נסגר. במצב הזה נחשף אתר הקישור של הסובסטרט השני AMP.

2. AMP נקשר- שינוי קונפרומציה נוסף. נוצרת קרבה מרחבית בין ATP ל-AMP.

נוצר מצב שמאפשר העברה מקבוצה לקבוצה ולא לתמיסה.

שני הסובסטרטים נמצא בתת סביבה מופרדת מהסביבה ולכן פוספט לא יברח לתמיסה.

מנגנון פינג פונג:

ניקח לדוגמא את אנזים אספרטאט אמינו טרנספראז- שתפקידו להעביר את הקב' האמידית של אספרטאט לחומצה קטוגלוטראטית.

סובסטרט A- חומצה אספרטית (אספרטאט) נקשר לאנזים --> האנזים לוקח ממנה את הקבוצה האמידית ומשחרר תוצר A- אספרטאט נטול קבוצה אמידית שנקרא "אוקסלואצטאט".

-->סובסטרט B–  חומצה קטוגלוטראטית נקשר לקומפלקס (אנזים+קבוצה אמידית)--> האנזים מחבר לסובסטראט את הקבוצה האמידית ומשחרר אותו בתור תוצר B- גלוטמט.

שיעור 6 בקרה אלוסטרית
דיברנו שבכל תא בכל נקודת זמן יש אלפי ריאקציות שקורות בו"ז.
אורגניזם רב תאי מצריך הרבה אנרגיה לצורך שמירה על ארגון פעילויות ותפקודית ולכן מערכת כזו שיש בה סדר וארגון צריך להשקיע הרבה אנרגיה כדי לשמור על הסדר. הפקת אנרגיה מפירוק של חומרי דלק בנוכחות חמצן וחשוב ביצירת אנרגיה פי 15 בנוכחות חמצן למשל בנשימה תאית.

מי שאחראי לרגולציה של רשתות מטאבוליות הוא באופן מפתיע מאוד- אנזימים.

היום נלמד על מנגנוני בקרה של אנזימים שנועדו לעשות סדר בכל המורכבות הזאת.

יש מספר מנגנוני בקרה.

מהי בקרה?

יש אנזים שיש לו פעילות מסויימת ואנחנו רוצים דרך להקטין או להגדיל אותה.

שיעור שעבר למדנו על מעכבים- אחת השיטות לויסות פעילות.

היום נלמד על: בקרה אלוסטרית

בקרה באמצעות איזואנזימים

בקרה ע"י מודיפיקציות קוולנטיות הפיכות: הוספה/ הורדה של קבוצות פוספט למשל

בקרה באמצעות חלבונים רגולטוריים: למשל חלבונים מעכבי פעילות עוברים אינרטאקיה על חלבון אחרי ובאמצעותה יש וויסות של הפעילות.

אקטיבציה פרוטאוליטית

Feedback regulation

בקרה באמצעות שליטה על כמות החלבון

מודולטורים (אפקטים) של פעילות

בקרה אלוסטרית

אנחנו נדבר היום על המוגלובין ונשווה אותו למיוגלובין וככה דרך ההשוואה נלמד על משמעות של אלוסטריות, קואפרטיביות.

מיוגלובין: חלבון שקולט חמצן ומצוי בעיקר בשרירים. אפיניות לחמצן גבוהה, אפילו בריכוזי חמצן נמוכים הוא כבר קושר חמצן ביעילות גבוהה. העקומה דומה למיכאליס מנטן. עקומה היפרבולית.

המגולובין: נושא חמצן ונמצא בתאי דם אדומים. אפיניות נמוכה יותר מיוגלובין עקומה סיגמולית כמו בצורת S.
אפיניות משתנה בתלות בריכוז חמצן, ככל שעולה הריכוז חמצן האפיניות גבוהה יותר. 

יש הבדל דרמטי בין הפעילויות של שני האנזימים האלה.

גרף דרגת רוויה כפנוקציה של סובסטרט:

במיוגלובין יש עקום קישור היפרבולי- עולה ואז מתחיל להתמתן. בהמוגלובין זה נראה כמו S.

ציר X לחץ חמצן חלקי באוטמוספירה (אקווילנטי לריכוז חמצן) ציר Y הפרקציה (חלק) של חלבונים שקשרו חמצן מכלל החלבונים .
כלומר באיזה ריכוז חמצן נקשרו חלבונים וזה גרף דומה למיכאליס מנטן, רואים שיש לו אפיניות גבוהה לחמצן כי כבר בריכוזים נמוכים יש היקשרות גבוהה לחמצן.
מיוגליבין גרף היפרבולי, המבוגליבין גרף S .
ערך 1.0 זה שכל החלבוני קושרי חמצן קשרו חמצן.

P50 – לחץ החמצן (ריכוז החמצן) שבו 50 אחוז מהמולקולות שלי קושרות חמצן. ריכוז שבו 50 אחוז מהאתרים תפוסים בחמצן.

-לשים לב שמדובר כאן שחלבונים קושרי חמצן למעשה מדברים על קישור ולא פעילות אנזים.

מה המקור להתנהגות השונה????

העקומה של ה-S נראית כמו עקומה שמאפשרת מעבר בין מצבים. יש טווח של חמצן שאין פעילות בכלל. יש טווח שבו אחוז הקישור עולה בצורה מוגברת. יש טווח שהעלייה מתמתנת ונשארת קבועה.

המוגלובין קושר חמצן בתאי דם, ומיוגלובין קושר חמצן בשריר.

למיוגלובין יש אתר אחד קושר חמצו ובהוגלובין יש 4 אתרים קושרי חמצן.

המבנה התלת מרחבי של מיוגלובין- חלבון מונומרי אחד עם אתר קישור אחד לחמצן. יש לו קבוצה פרוסטטית- הים. טבעת פורפרין שקשורה לשרשרת הפוליפפטידים ולמעשה אף פעם לא עוזבת אותה. היא תמיד קשורה לחלבון באינטראקציות לא קוולנטיות מאוד חזקות.

המבנה התלת מרחבי של המוגלובין: 4 מונונמרים, השונים זה מזה. זו מולקולה הטרומרית. שני זוגות תת יחידות אלפא וביתא. לכל תת יחידה יש קבוצה פרוסטטית. יש דמיון רב בין מבנה תלת מרחבי של מיוגלובין למבנה של תתי היחידות של ההמוגלובין.

ההבדלים בתפקוד:

צורת קישור סיגמואידלית- גרף בצורת S, לעומת צורת קישור היפרבולית- עלייה שמתמתנת.

4 אתרי הקישור בהמוגלובין קושרים את החמצן בצורה קואופרטיבית.

ההבדלים במבנה כנראה מכתיבים את ההבדלים בתפקוד.

דרגת רוויה= סה"כ האתרים הקשורים לחמצן חלקי סה"כ האתרים.

מה קורה במיוגלובין? (משוואות מצגת)

ניתן לומר שזה סה"כ (ריכוז מיוגלובין* חמצן) חלקי (מיוגלובין* חמצן + מיוגלובין חופשי)

P50: לחץ החמצן בו 50% מהמולקולות רוויות.

לפי המשוואות במצגת אפשר לראות שמיוגלובין הוא אנזים מיכאליני.

מה קורה בהמוגלובין?? (משוואות מצגת)

Hb(O₂)_n<--àHb + nO₂

זה כיתוב של הכל או לא כלום. או שכולם קשורים או שאף אחד לא קשור. אין מצב ביניים.

בשיווי משקל מתקבלת חזקה מעריכית.

רק אם n=1 האנזים יתנהג בצורה מיכאליאנית.

אחרת- נקבל עקומות בצורת S.

n_H- קבוע Hill- מגדיר מה מידת התקשורת בין אתרי הקישור על פני המולקולה.

1_H (n- מספר תתי היחידות)

מעיד על מידת הקואופרטיביות.

מקבלים את הערך הזה בתור שיפוע הגרף בלינאריזציה שרואים במצגת.

קואופרטיביות: מידת התקשורת, הצימוד בין האתרים המרובים של חלבון אוליגומרי.

ניתן להגדירה גם כך: איך קישור הסובסטרט לאתר אחד משנה את האפיניות של אתר אחר לאותו הסובסטרט.

אנזימים שמראים קינטקיה סגימואידלית הם תמיד אנזימים בעלי מספר תת יחידות ותקשורת ביניהם.

אם אנזים מראה קינטיקה היפרבולית זה לא בהכרח אומר שהוא לא אלוסטרי. יכול להיות שהוא אנזים אלוסטרי תחת בקרה שהפכה אותו לאנזים מיכאליאני.

קינטיקה היפרבולית: או אוליגומרי בלי תקשורות, או מונומרי, או אלוסטרי תחת בקרה שהופכת אותו לאזים מיכאליני.

יתרונות הקואופרטיביות להובלת חמצן:

נשווה בין שני מקרים:

ניקח המוגלובין- חלבון עם 4 תתי יחידות שיש ביניהן תקשורת, ועקומת קישור סיגמואידלית.

(מידת רוויה כפונקציה של לחץ חמצן).

נשווה לחלבון טטראמרי כאשר תתי היחידות פועלות בצורה בלתי תלויה- אין תקשורת.

כשהאתרים לא בתקשורת מתקבלת התנהגות של מיכאליס מנטן- היפרבולית

מה קורה מבחינה פיזיולוגית כאשר עוברים מהריאות (לחץ חמצן גבוה) לאזור רקמות (לחץ חמצן נמוך)?

בריאות מידת הרוויה היא 1. רוב מולק' ההמוגלובין טעונות בחמצן.

באנזים הלא קואופרטיבי: עבורו לא הגענו לרמת קישור מקסימלית- קושר הרבה פחות חמצן.

ברקמות: לחץ חמצן קטן יותר- דרגת קישור קטנה יותר.

ההמוגלובין ישחרר 60% מהחמצן שהוא נושא משום שהלחץ החלקי שם קטן.

אנזים לא קואופרטיבי ישחרר הרבה פחות- 38%.

ההמוגלובין מורכב מ-4 תתי יחידות . יש זהות במרחב. יש סימטריה. כל אתר דומה לאחר. אנחנו יודעים שיש תקשורת בין האתרים. הם יחסית רחוקים אחד מהשני. מה מאפשר את התיאום הזה מבחינה מנגנונית?

תקשורת בין אתרים:

שינויים מבניים בין המצבים יכולים להסביר תקשורת.

יש קופקטור מסוג קבוצה פרוסטטית. היא מורכבת מאטום ברזל בעל תפקידי קטליטי חשוב והוא קשור ל-4 טבעות חנקניות.

מה שקושר את הטבעת הפורפרינית הזו הוא חומצת היסטידין שקשורה גם היא לברזל.

כשנקשר חמצן: הוא נקשר לאטום הברזל. כתוצאה אטום הברזל נכנס יותר פנימה למישור הטבעת הפורפרינית.

זה השינוי המבני הראשון שרואים.

מה קורה לשייר ההיסטידין כשהברזל נכנס פנימה? שייר ההיסטידין משנה גם הוא את המיקום שלו במרחב. למעשה תנועת הברזל לתוך קבוצה ההים (הטבעת הפורפרינית) משנה את האוריינטציה של שיירים סמוכים.

גם חומצה אימדוזולית משנה את האוריינטציה שלה.

שייר ההיסטידין הוא במבנה אלפא הילקאלי.

חמצן נקשר-> ברזל נכנס פנימה-> היסטידין עולה למעלה-> גורם להטייה של האלפא ההליקס אליו הוא שייך. האלפא הליקס עצמו פונה לכיוון אינטרפייס של מגע בין כל שתי תתי יחידות של המוגלובין--> השפעה על תתי היחידות האחרות שאיתן הוא באינטראקציה.

יש כאן בעצם שינויים מקומיים שהולכים ומתרחבים.

שינויים שקורים בתוך תת יחידה: שינויים טרציאריים.

ברגע שעוברים לתת יחידה שנייה: שינויים קוואטרנאריים.

מולקולת ההמוגלובין במצב קשור נראית במצב מרחבי שונה מזה שבו היא לא קושרת חמצן.

בעצם לחלבון יש שתי צורות תלת מרחביות- צורה שבה הוא קשור חמצן, צורה שבה הוא לא קושר חמצן. יש כאן שינויים מבניים גם שלישוניים וגם רביעוניים.

יש כאן קונספט מאוד מרכזי באלוסטריה:

יש צימוד בין קישור לגאנד לשינויי קונפורמציה בחלבון.

Binding induced conformational changes:

מבחינה תרמודינמית:

קונופורמציה אוקסי <----> קונפורמציה דאוקסי.

ש"מ בין שני הקונפורמציות.

הליגאנד לא נקשר באותה אפיניות לשני המבנים האלו- בגלל שהם שונים זה מזה.

יש מעגל תרמודינמי בין צורון קושר לצורון לא קושר.

יש קישור טוב יותר בקונפורמציה האקטיבית- זו שקשורה מלכתחילה ללגנד.

לראות סכימה ממחישה במצגת.

מודל MWC:

המודל המתואם/ הסימטרי.

העיקרון הבסיסי הוא ששינוי קונפרומציה מצומד לקישור ליגאנד.

ניקח חלבון עם 4 תתי יחידות. יודעים שהמוגלובין נמצא בש"מ בין שתי הקונ' אוקסי ודאוקסי. קראו להן T ו-R במודל הזה.

הניחו שהוא נמצא בש"מ בין שתי הקונפרומציות האלו גם ללא סובסטרט.

במודל הזה רואים שכל 4 תתי היחידות משנות את המצב שלהן מריבוע לעיגול בבת אחת. לכן זה מכונה המודל הסימטרי. גם ריבוע וגם עיגול יכול לקשור סובסטרט.

חמצן יכול להקשר גם לקונפ' T (ריבועים) וגם R (עיגולים), כאשר ל-R הוא נקשר טוב יותר- וזוהי הקונ' האקטיבית.

כאשר מוסיפים חמצן: יש קישור גם ל-T וגם ל-R. קורה בצורה הדרגתית. יש ש"מ L שמתאר את היחס בין T ו-R בהיעדר סובסטרט.

קישור החמצן להמוגלובין קורה בצורה הדרגתית ובלתי תלויה לשני הצורונים.

במודל הזה ההנחה היא ששינויי הקונ' מתואמים, אבל שכל צורון קושר את החמצן באופן בלתי תלוי.

המשוואה המתמטית שמתארת את המודל לוקחת בחשבון שני פרמטרים: היחס בין הצורונים בהיעדר סובסטרט, והיחס בין קבוע ש"מ R וקבוע ש"מ T.

ככל שיותר לגנדים נקשרים השיווי משקל בין שני הצורונים מוסט לכיוון הצורון האקטיבי.

מראה גרף של תלות ריכוז הצורונים השונים בריכוז הלגאנד.

ככה מתקבל הסבר מתמטי להתנהגות סיגמואידלית.

גדולת המודל היא פשטותו המתמטית.

להסביר

מודל KNF

המודל הזה מניח ששינוי הקונפרומציה מושרי הליגנד לא קורים בצורה מתואמת אלא הדרגתית.

מתואר באופן הבא:

יש 4 תת יחידות ריקות, כל אחת בצורה מרובעת. רק כאשר חמצן נקשר יש שינוי קונ' רק באותה תת יחידה שאליה החמצן נקשר. ברגע שחמצן נקשר התת יחידה הופכת לעיגול.

יש לנו כאן 4 קבועי ש"מ בין 4 צורות שונים: 4 ריבועים, 3 ריבועים ועיגול אחד, 2 ריבועים 2 עיגולים...

ככה שיש יותר תת יחידות קשורות הקישור הבא חזק יותר.

גם המודל הזה מראה לנו עקומות סיגמואידליות.

שני המודלים האלה מתארים את ההתנהגות הקינטית של ההמוגלובין מאוד טוב.

איך נדע מי מהמודלים נכון לגבי כל חלבון?? שנים של מחקר...

כל חלבון פועל לפי מודל אחר.

2 רמות בקרה על חלבונים אלוסטרים:

1. הומוטרופיק אפקט: הסובסטרט הוא מי שמשרה את האפיניות לעצמו. קשירת סובסטרט משפיעה על האפיניות של הקישור של הסובסטרט עצמו ביתר אתרי הקישור.

2. הטרוטרופיק אפקט: קישרה של מולקולה אחרת משפיעה על הקונפורמציה והאפיניות לקישור לסובסטרט.

האפקטים האלה יכולים להיות או חיוביים או שליליים.

הומוטרופי חיובי: קישור סובסטרט לאתר אחד מגביר את האפיניות לאותו הסובסטרט של אתר אחר באותו אנזים.

שלילי: מקטין אפיניות.

אפקט הטרוטרופי שלילי: מולקולה נקשרת באתר בחלבון ומייצבת את הקונפורמציה הלא אקטיבית. נקרא מעכב אלוסטרי.

אפקט הטרוטרופי חיובי: מולקולה נקשר באתר בחלבון ומייצבת את הקונפוקמציה האקטיבית.

אם נוסיף משפעל אלוסטרי- עקומת S תזוז שמאלה ונקבל עקומה היפרבולית (אפיניות גדולה יותר, קואופרטיביות קטנה יותר).

בלי כלום- עקומת S

עם מעכב- עקומת S תזוז ימינה. האפיניות קטנה יותר, קואופרטיביות גדולה יותר.

<<< להבין דרך המצגת>>

בהמוגלובין: חמצן הוא אפקטור הומוטרופי.

אפקטור אלוסטרי על המוגלובין: 23BPG

אינראקציות לא קוולנטיות עם שיירים בחלבון.

היא אפקטור אלוסטרי הטרוטרופי שלילי. נקשרת לאתר שונה מאתר הקישור לסובסטרט ומקטינה את האפיניות שלו.

האפיניות קטנה וקואופרטיביות גדלה.

יוני נחושת ומולק' סי או 2 הם אפקטורים הטרו' שליליים.

במעבר לרקמות האפיניות לחמצן קטנה והקואופרטיביות גדלה.

לכן ההמוגלובין משחרר את החמצן בצורה מועצמת- זה נקרא אפקט בור:

pH נמוך--> היסטידין מקבלת מטען חיובי ויוצרת גשר מלח ע"י קישור עם שייר של אספרטאט. גשר המלח הזה מייצב קונ' T.

CO₂: נקשר לקצה האמידי של החלבון. הקישור הזה משרה מטען שלילי שיוצר גשר מלח עם שיירי היסטידין שמייצב קונפורמציה T.

בנוסף הקישור של ה-CO₂ לקצה האמידי גורם לשחרור של פרוטון- שתורם להורדת ה-pH.

מעכב אלוסטרי הטרוטרופי נוסף: 2,3BPG- מולקולה טעונה שלילית שנכנסת בתוך חור טעון חיובית שנמצא רק בקונ' T. בעצם מייצב קונ' T.

מזרזר ריאקציה של דחיסה של קרבמויל פוספט ואפסרטאט לאן קרבמויל אספרטאט שהוא חומר מוצא חשוב לפירידמידינים ופורנים.

התוצר הסופי CTP של המסלול משמש כאפקטור שמווסת את הריאקציה עצמה- n product inhibition.

התוצר הזה אינו מעכב תחרותי, לא דומה לסובסטרט. הוא נקשר לאתר אלוסטרי אחר ומשפיע על תפקוד החלבון.

יש שני סובסטרטים, מוסיפים אנזים ורואים את מהירות הריאקציה. רואים שעם הצטברות התוצר הפעילות יורדת.

ה-CTP נקשר באתר רגולטורי.

האנזים ATcase אינו מתנהג לפי מנגנון מיכאליסמנטן. מקבלים עקומה סיגמואידית- כלומר האנזים הוא אלוסטרי עם מספר תתי יחידות.

CTP הוא אפקטור אלוסטרי מעכב ולכן הוא מסיט את העקומה ימינה לאורך ציר הריכוז. הוא מקטין את האפיניות ומגדיל את הקואופרטיביות.

הוא מודולטור הטרוטרופי שלילי.

ריכוז האספרטאט שצריך כדי להגיע למחצית פעילות מקסימלית בנוכחות CTP הוא גבוה יותר מהריכוז בצריך בהיעדר CTP. CTP מקטין אפיניות אנזים סובסטרט.

ATP הוא גם מודולטור של הריאקציה הזו. במקרה זה הוא אקטיבטור. הנוכחות שלו מגדילה איפניות ומקטינה קואופרטיביות.

ATP נקשר באתר אחר ומסיט את העקומה שמאלה לאורך ציר הריכוז.

המודל האלוסטרי שמתאר את פעילות ATcase הוא המודל המתואם MWC.

מה ניתן ללמוד על ATcase מניסיונות ביוכימיים???

משקל מולקולרי של החלבון:

ניתן לקבוע אותו בכמה דרכים:

בידוד החלבון (או מקרמות נטיביות או בצורה רה קומביננטית), ולמדוד את המשקל או בצנטרפוגה, או בקליברציה ע"י כרוטוגרפיה של גודל, או ע"י mass pack.

קביעת משקל מולק':

אולטרא צנטרפוגציה אנליטית:

מטעינים דוגמאת חלבון מעל מדיום מאוד צמיג (סוכרוז למשל) ומכניסים לאולרא צנטרפוגה. חלבונים וחלקיקים גדולים שוקעים למיקומים שונה לאורך המבחנה הצמיגה בהתאם לגודל שלהם. ככל שנתרחק יותר מפני שטח המבחנה המשמעות היא שהחלקיק יותר כבד.

ככה נדע מה המשקל המולקורי הכולל של החלבון שלנו.

כאשר נריץ דוג' חלבון כזה ונריץ אותו ב-SDS פייג': החלבונים רצים על פני ג'ל בהתאם למשקל שלהם:

נראה שני פסים עיקריים= כלומר יש שני סוגי תתי יחידות כל אחת בגודל שונה (נקרא להן C R)

ל-ATcase יש משקל מולקולרי שמתאים לקומבינציה של 6 תתי יחידות מסוג C ו-6 תתי יחידות מסוג R. מסיקים את זה מתוך סטויכומטריה.

טיפול כימי באמצעות ריאגנטים ספציפים לקב' פונקציונאליות ספציפיות

פארא הידרוקסי אתיל בנזואט: ספציפית לשיירי ציסטאין.

כאשר נדגיר את ATcase עם הריאגנט הזה נראה שהחלקיק נפרד בעצם לשני חלקים.

נוכל לבדוק את הפעילות של כל חלק.

את הדוג' שעברה טיפול אפשר להריץ באולטראצנטרפוגציה אנליטית: נקבל שני פיקים שמתאימים לשני חלקים של החלבון.

כל אחד מהפיקים האלה מתאים למשקל מולקולרי של דימר של יחידה אחת וטרימר של יחידה שנייה.

C₆r₆à 3r₂+ 2C₃

אלה התוצרים של הטיפול עם הריאגנט הספציפי.

עכשיו ניקח את r₂ ו-c₃ ונבדוק את הפעילות שלהם:

כאשר נבדוק את הפעילות של הטרימר הקטליטי: יש פעילות קטליטית- כלומר יש דחיסה של שני הסובסטרים, אבל יש שני הבדלים עיקריים:

1. העקומה הפכה להיות היפרבולית- מיכאליאנית. 3 תתי יחידות שאין תקשורת ביניהן.

בהעדר תתי יחידות רגולטוריות (r₂) אין תקשורת.

2. כשמוסיפים CTP- אין שינוי.

כאשר נבדוק את הדימר הקטליטי r₂:

1. אין פעילות בכלל

2. ה-CTP ןה-ATP נקשר אליו

ATcase הוא אנזים בעל מבנה מיוחד:

שני טרימרים נמצאים בליבה ו- 3 דימרים עוטפים אותם.

אטום אבץ משחק תפקיד חשוב בייצוב היחידה הרגולטירית: הוא קשור ל-4 שיירי ציסטאין בצורה טטראהדרלית. מייצב את המבנה שלהם ואת האינטראקציה שלהם עם היחידה הקטליטית.

ההבנה שכך זה בנוי עוד לפני שעשו פענוח מבנה נובע מהניסיונות הביוכימיים.

פענוח מבנה האנזים: לראות תמונה במצגת.

במבנה רואים שיש הרבה אינטראקציה בין אתרים רגולטורים לאתרים הקטליטיים- שטח מגע גדול ביניהם.

יש כאן קורלציה בין מבנה לתפקוד:

ל-ATcase יש שתי קונפורמציות שונות- אחת ללא סובסטרט ואחת עם סובסטרט.

יש התרחקות של שני הטרימרים הקטליטיים כאשר יש קישור סובסטרט.

קונפורמציה אקטיבית- R,קונ' לא אקטיבית –T.

המודל המתאים לו כאמור הוא MWC.

כשיש שני מצבי קונ' עיקריים אחד אקטיבי ואחד לא ולאור עדויות הבקרה החליטו שזה MWC.

איך נזהה את האתר הקטליטי???

דרך אחת מקובלת לעשות זאת היא לפתור את המבנה הקשור לסובסטרט.

אי אפשר לגבש אנזימים עם הסובסטרט עצמו שלהם כי הסובסטרט עובר כימיה.

מה עושים? משתמשים באנלוג של סובסטרט שלא עובר כימיה.

לקחו אנלוג שנקרא PALA. זו מולק' שמחקה תוצר ביניים בריאקציה. זו מולק' ביסובסטרט כי היא מכילה חלקים שדומים לשני הסובסטרטים.

היא נקשרת לחלבון, לא עוברת כימיה, ומייצבת אותו בקונ' R.

יש מאסף שיירים קרובים במרחב באתר הפעיל שתורמים לאינטראקציות בין האנזים לסובסטרט.

לאנלוג של סובסטרט יש המום אטומים פולריים שיכולים לעבור שלל אינטראקציות עם שיירים צידיים של ח"א קרובות במרחב.

כל אנלוג של סובסטרט נקשר עם שיירים מנתרמים מכל אחת מתתי היחידות.

הוא נקשר באינטרפייז בין תתי יחידות. יש 3 אתרי קישור סובסטרט שנמצאים באינטרפייז בין תתי יחידות.

כאשר הסובסטרט נקשר יש שינויים קונפורמציונאליים משמעותיים.

PHMB- הריאגנט הספציפי ממקודם שנקשר לשיירי ציסטאין. הוא נקשר לקב' SH ריאקטיביות מאוד- שיירי ציסטאין שמייצבים את המתחם הרגולטורי.

PHMB- נקשר לציסטאינים שבאינטראקציה עם אבץ, ובעצם מבטלת את יציבות האתרים הרגולטורים ולכן הייתה היפרדות בין החלקים הרגולטורים לחלקים הקטליטיים.

קונ' T ו-R  נמצאות בש"מ, כאשר קבוע אלוסטרי l מכתיב את היחס ביניהן. ככל שנלך ונוסיף סוב' נסיט את ש"מ לכיוון הקונ' האקטיבית R.

ככל שמצב האיכלוס של המולקולה ע"י סובסטרט גבוה יותר, הש"מ מוסט לכיוון הקונ' האקטיבית.

אפקטורים אלוסטריים- CTP ו-ATP נקשרים באתרים הרגולטוריים ומשפיעים בעצם בעיקר על ההסטה של ש"מ בין קונ' T ו-R בהיעדר סובסטרט. ז"א הם משנים את L.

CTP ו-ATP נקשרים באותו האתר בדיוק בדימרים הרגולטוריים, כאשר האחד מייצב קונ' R והשני מייצב קונ' T.

אתר רגולטורי יכול להיות בתת היחידה הקטליטית או בתת יחידה רגולטרית נפרדת.

במקרה של ATcase האתר הרגולטורי נמצא על תת יחידה רגולטורית נפרדת.

היחס בין T ל-R הוא מכתיב את התקשורת בין תתי היחידות. ככל שיש יותר T מאשר R יש תקשורת יותר חזקה.

כאשר מוסיפים סובסטרט:

אם הסובסטרט נקשר באותה האפיניות ל-R ול-T:

הוא לא יניע את ש"מ בין T ל-R לכיוון כלשהו.

אם נוסיף ליגנד שנקשר טוב יותר ל-R מאשר ל-T, שיווי המשקל יוסט לכיוון קונ' R.

עד עכשיו דיברנו על בקרה לוקאלית אלוסטרית על פעילות אנזימים שקורית בסביבתו של האנזים.

מנגנון הבקרה שנדבר עליו עכשיו הוא מנגנון שנקרא.

שימוש באיזואנזימים:

חלבונים שונים בעלי אותה פעילות אנזימטית שמופיעים באותו ייצור.

זה לרוב גן שעבר רפליקציה.

יש הבדל קטן בין הפעילות הקטליטית של שני איזואנזימים.

האנזימים הם הומולוגיים ברצף במבנה ובתפקוד, אבל בעלי יכולות קינטיות שונות.

לקטאט דה הידרוגנאז: אנזים טטראמרי בעל שני מופעים:

תת יחידה מטיפוס H- נמצא ברקמות לבביות

תת יחידה מטיפוס M- נמצא בשריר

ההבדל בין האיזואנזימים מתבטא בתתי היחידות שלהם. כל איזואנזים יהיו בנוי מהרכב שונה של יחס בין H ל-M. איזואנזים עם תת יחידות שכולן M, איזואנזים עם תת יחידות שכולן H, איזואנזים עם 1 M ו-3 H וכו'...

צירופים שונים של תתי היחידות האלו קיימים ברקמות שונות.

בשריר הצורון M4 הוא הכי נפוץ- מותאם לאזורים דלי חמצן

בלב הצורון הכי נפוץ הוא H4.

במהלך שלבי התפתחות שונים של יצור הצורון של לקטאט דה הירוגננאז משתנה ביחסים.

הבקרה היא לא רק מבחינת רקמות שונות, אלא גם מבחינת מימד הזמן כפונקציה של הצרכים ההתפחותיים.

עם התבגרות היצור יהיה שינוי באחוז הצורונים שמתאימים לפעילות אירובית למשל.

בקרה באמצעות מודיפיקציות קוולנטיות הפיכות:

הבקרות האלו הפיכות. הן פחות מיידיות מבחינת ציר זמן לעומת בקרה אלוסטרית. יש להן חשיבות במגוון עצום של תהליכים, בעיקר תהליכי מעבר אותות.

במערכות של מעבר אותו יש מודיפיקציות קוולנטיות שמשחקות תפקיד עיקרי.

מודיפיקציה קוולנטית היא שינוי פעילות האנזים באמצעות התמרה של קבוצה כימית למשל: קרבוקסילציה, פופסורילציה, אצטילציה...

מצמידים קב' פונקציונאלית לחלבון באמצעות קשר קוולנטי.

ATP הוא דונור שתורם קב' פוספט PO₃^- לחלבון בצורה קוולנטית באמצעות תהליך פוספורילציה.

אצטיל קו A- דונור של קב' אציל.

הדונור תורם את הקב' הפונקציונאלית.

המון תהליכים ביולוגיים מתווכים ע"י בקרה קוולנטית. רגולציה של מסלולים מטאבוליים היא מערכתית, שמערבת גם בקרות מקומיות.

הצמדת קב' פונקציונאלית לחלבון תשנה את הפעילות שלו- או שיהיה אקטיבי יותר או שיהיה אקטיבי פחות. היא משנה את ההתנהגות הפונקציונאלית של האנזים.

דוגמא של פוספרילציה:

תהליך מאוד חשוב שבו לוקחים שיירי חלבון בעיקר של סרין טריאונין, לפעמים תירוזין, ובאמצעות שימוש ב-ATP כדונור, חלבון (אנזים)שנקרא פרוטאין קינאז יוסיף פופסט לשייר.

כדי לעשות את התהליך הזה צריך אנרגיה ליצירת הקשר. הידרוליזה של מולק' ATP תשחרר את האנרגיה שמנוצלת ליצירת הקשר של השייר לפוספט.

פוספורילציה היא תהליך התמרה קוולנטית הפיך. אפשר לגרום לחלבון לאבד את קב' הפוספט ולעבור הידרוליזה חזרה לחלבון לא מפוספר ע"י דה פוספורילציה. התהליך הזה של הדירוליזה של קשר פופסו אסטרי נעשה ע"י אנזים שנקרא פוספטאז.

המעבר מצורון עם פוספט לצורון בלי פוספט הלוך וחזור נעשה ע"י שני אנזימים שונים. אלה ריאקציות שונות, אין כאן ש"מ בין ריאקציות כימיות שמזורזות ע"י אותו אנזים בשני הכיוונים.

זה הפיך בהיבט שזה נעשה בכימיות שונות לחלוטין, ולא בהיבט של ש"מ.

שתי הריאקציות הלוך וחוזר נוטות לקרות בצורה ספונטנית. דלתא G שלילי בשני הכיוונים.

זאת בגלל שאלה שתי ריאקציות כימיות שונות.

הצורה המזורחנת יכולה להיות פעילה יותר או פחות כתלות בפונקציה של החלבון.

הוספת זרחן מוסיפה מטענים שליליים, מוסיפה פולאריות, יכולה לשנות ש"ם בין קונפורמציות T ו-R- יכול לעזור או להזיק, תלוי מה החלבון עושה.

תמיד בתהליך פוספורילציה מעורב נוקלאוטיד עתיר אנרגיה, בד"כ ATP.

יש קשר בין סטאטוס האנרגיה של התא לבין הריאקציות המטאבוליות שהחלבונים האלה מעורבים בהן.

<<מראה טבלה של קינאזות שונות ואין הן מופעלות>>

הקינאזות נתונות לבקרה ע"י סיגנלים שונים שמשפעלים אותן. המון תהליכים מווסתים ע"י קינאזות. באאו' יש 500 גנים שונים לחלבונים שמצבעים פופסורילציה (או בעברית- זרחון).

יש הרבה מעורבות בתהליך של מעבר אותות.

אנזים שמבוקר ע"י זירחון:

גליקוגן פוספורילאז: מעורב במטאבוליזם של גליקוגן.

החלבון הזה נתון לבקרה גם באמצעות זרחון וגם באמצעות בקרה אלוסטרית.

האנזים הזה הוא דימר. מכיל שני שיירי סרין שיכולים לעבור זרחון.

פופסורילאז קינאז תוקף את שיירי הסרין.

פוספופרוטאין פוספטאז עושה דה פוספורילציה.

יש גם בקרה אלוסטרית ע"י אפקטורים אלוסטרים AMP, ATP, G6P.

הבקרות על האנזים הזה הן משולבות (לראות סכימה במצגת).

בקרה על אנזימים באמצעות אקטיבציה פרוטאוליטית:

במצב הזה חלבון יכול לעבור אקטיבציה ע"י חיתוך פרוטאוליטי.

אנזימי עיכול פרוטואוליטים ששוברים קשרים פפטידיים מיוצרים בלבלב ובקיבה בצורה לא פעילה שלהם.

החלבון הלא אקטיבי נקרא זימוגן. רק בעקבות חיתוך פרוטאוליטי ספציפי הוא הופך להיות פעיל.

החיתוך הפרוטאוליטי לא דורש אנרגיה, הוא קורה סופנטאנית, וקורה רק פעם אחת בחייו של החלבון.

המנגנון כאן הוא בלתי הפיך. מרגע שחתכנו את החלבון- הוא פעיל.

דוג' לאנזימים כאלה: פפסינוגן, טריפסינוגן, כימוטריפסינוגן.

ברגע שטריפסינוגן הופך לטריפסין ע"י פרוטאזה אחת, הטריפסין הופך פעיל ועושה חיתוך ליתר הזימוגנים.

תהליך קרישת הדם הוא מתווך ע"י מפל של שפעולים פרוטאוליטים- אחד משפעל את השני וככה נוצרת קרישת דם.

תהליך בקרה הורמונלית: הרבה הורמונים מסונתזים כפרוהורמונים ורק אחרי חיתוך פרוטאוליטי הופכים להורמון פעיל.

מוות מתוכנן של תאים: חלבונים שנקראים קספאזות חותכים קשרים. הם עצמם מסונתזים כפרוקספאזות.

כימוטריפסינוגן:

באמצעות טריפסין יש חיתוך פרוטאוליטי בין שייר 15 ל-16 לקבלת פאי כימוטריפסין, ויש חיתוך נוסף באמצעות כימוטריפסין פאי ל-3 קטעים שנקראים אלפא כימוטריפסין.

כאשר נבדוק את המבנה של כימוטריפסין וכימוטריפסינוגן:

מבחינה מבנית אין כמעט הבדלים. בכ"ז כימוטריפסינוגן לא פעיל, וכימוטריפסין כן. למה?

באיזולאוצין מס' 16 קורה שינוי דרמטי מבחינה מרחבית.

נתפקס על השלשה הקטליטית: אפרטית 102, סרין 195, והיסטידין 57:

בזימוגן לא רואים חור אוקסיאניוני וגם אתר ההיכרות של הסובסטרט לא נמצא.

כאשר עושים חיתוך ראשון בין שייר 15 ל-16 קורים שינויים מבניים:

מייצרים את האתר הקטליטי בצורתו השלמה. גורמים למיקום השלשה הקטליטית במקום. יוצרים את החור האוקסיאניוני. יוצרים את כיס ההיכרות.

מראה את הקשרים הכימים שנוצרים אחרי החיתוך- להסתכל במצגת.

השינויים המבניים קורים באתר של השלשה הקטליטית.

השפעול הפרוטאוליטי קורה פעם אחת בחייו החלבון- מזימוגן לאנזים פעיל.

מה מונע מאנזים פרוטאוליטי לחתוך כל אנזים אחר שנקרא בדרכו??

חלבונים רגולטוריים

לטריפסין יש מעכב חלבוני שנקשר אליו באפיניות אדירה לאתר הפעיל ומונע ממנו לחתוך.

יש לו שייר אחד חשוב- שייר ארגינין 15. החלבון באמצעות התיווך של השייר הזה נקשר לטריפיסין. יש כאן קומפלקס אנזים מעכב שמונע מטריפסין לבצע את הפונקציה שלו.

יש התאמה מושלמת בין הטריפסין למעכב.

שייר הארגינין  הזה עובר אינראקציה מאוד חזקה עם החומצה האספרטית שבכיס ההיכרות של הטריפסין.

תהליך קרישת דם:

אנזימים עוברים שפעול אחד אחרי השני עד שמגיעים לאנזים האחרון שברגע שמשופעל הופך להיות לא מסיס-> מקבלים סיבים לא מסיסים של חלבון שאחראיים לקרישת הדם (מבקש לקרוא את זה מהספר)

 חלק 8: ליפידים וממברנות

הממברנה היא גבול בררני שמבדיל את הסביבה התוך תאית מהסביבה החיצונית.

מי שאחראי על הסלקטיביות הוא חלבונים שנמצאים בממברנה.

הממברנה מהווה גבול חדירות בין הפנים לבין החוץ, אבל לא רק. כלומר ממברנה היא חצי חדירה.

הממברנות לא רק מרכיבות את גבול התא החיצוני. יש אברונים בתוך התא שמוקפים גם הם בממברנות- למשל מיטוכונדריות.
ממברנות הן דקות בין 60-100 A.

הממברנות מורכבות מליפידים וחלבונים. ליפידים הם המרכיבים הבסיסיים בממברנה. החלבונים נותנים לממברנה את התכונות הפונקציונאליות שלה ומהווים כ-50% מהממברנה.
החלבונים יכולים להוות כרצפטור קבלת אות מסיגנל חיצוני ולהפעיל ריאקציות בתוך התא גם מבלי שהסיגנל יכנס פנימה.

לליפידים בממברנה יש אופי אמפיפתי- הידרופובי והידרופילי. הליפידים יוצרים באופן ספונטני שכבה כפולה מבודדת ומהווים את מחסום החדירות – מקור המחסום הוא מליפידים. הרכיב שכן מאפשר את המעבר בכל זאת הוא מהחלבונים.

הכוחות שמייצבים את הממברנה הם בעיקר אינטראקציות הידרופוביות, וכן אינראקציות פולריות אחרות. החלבונים בממרנה הם ספציפים: משאבות, רצפטורים, נשאים..

ממברנות הן אסימטריות- צד אחד לא דומה לשני. החלבונים בממברנה נמצאים באוריינטציה מאוד ספציפית. הממברנות משמשות כממס דו מימדי לחלבונים שפרושים בתוכן.  הממברנה היא מבנה דינמי ולא סטטי. נוזל דו מימדי בערך פי 100 יוצר צמיג מהמים שמשמש כסולבנט לחלבונים ממבראנליים. רוב הממברנות יכולות להפריד מטען בין פנים לבין חוץ- וזה הבסיס לסיגנלים חשמליים.

ההפרדה הזו יוצרת פוטנציאל חשמלי.

פחמימות – הן פוליהידרוקסי אלדהידים או קטונים. קיימות שלושה קבוצות עיקריות של פחמימות:
1. חד סוכרים (סוכרים פשוטים) – מורכבים מיחידה אחת של פוליהדרוקסי אלדהיד או קטון. חד סוכרים בעלי ארבעה פחמנים או יותר יטו ליצור מבנה טבעתי להגברת היציבות.
2. אוליגוסוכרים – מורכב משרשרות קצרות של יחידות או שיירים של חד סוכרים הקשורים בקשרים גליקוזידיים. לדוגמה דו-סוכר מורכב משני יחידות של חד סוכר.
3. רב סוכרים – פולימר ארוך של סוכרים המכילים יותר מ-20 יחידות של חדי סוכרים עד כדי מאות או אלפים.

שתי משפחות החד סוכרים:
א. אלדוז – אם קבוצת הקרבוניל (C=O) נמצאת בקצה שרשרת הפחמן בקבוצת אלדהיד (CHO).
ב. קטוז – אם קבוצת הקרבוניל (C=O) נמצאת בפחמן אחר בקבוצת הקטון (C=O).

שרשרת פחמנים יכולה לקבל שתי קונפורמציות או שרשרת פתוחה או סגורה טבעתית כאשר קבוצת אלדהיד או קטון תוקפת את אחת מקבוצות ה-OH. צורת הטבעת יציבה יותר, והיא יכולה להתחבר לקבוצת OH אחרת וכך המבנה שלה גם שונה.
יש עדיפות למתמירים הגדולים לתפוס עמדות אקווטוריאליות כי יש בה פחות הפרעות סטריות.

אם נשווה בין מולקולות נוכל להשתמש במושגים מתארים:
- איזומרים – בעלי נוסחא כימית זהה אך סידור אטומים שונה.
- סטריאואיזומרים – נוסחא וסידור זהה אך מבנה מרחבי שונה.
- אננטיומרים – דוגמה לסטריאואיזומריה שבו ניתן לראות שני מולקולות שהן המראה והראי של אחת השנייה. קונפורמציות D ו- .Lכשיש לפחות פחמן כיראלי אחד. זה גם איזומר אופטי.
- אפימרים – צמד סוכרים הנבדל רק בקונפורמציה סביב אטום פחמן אחד.
- אנומרים – איזומריה הנוצרת עקב סגירת טבעת ויצירת פחמן כיראלי נוסף.
פחמן אנומרי – פחמן כיראלי א סימטרי.

כלל השונויות הללו מגנה מגוון רחב יותר של תצורות שיכול להיות והוא מניב תכונות שונות. זה מעלה ומגביר את המגוון והשונות הקיימת.

חומצת שומן רוויה – רווי במימנים ולכן אין קשרים כפולים. נק' רתיחה גבוהה יותר.
חומצת שומן בלתי רוויה – לא רווי במימנים ולכן יש קשרים כפולים במקום. נק' רתיחה נמוכה יותר.

חומצות שומן ארוכות עם יותר פחמנים יעלו את נקודת הרתיחה לעומת חומצות שומן קצרות יותר.

ליפידים: מולקולות לא מסיסות שיש להן קצה הידרופובי והידרופילי . יש להם תפקידים רבים:

מרכיבי ממברנות, משמשים כחומרי דלק, משמשים כמחסני אנרגיה, משמשים במולקולות שמשתתפות בהעברת אותות, משמשים כחומרי סיכה.

כיצד ליפיד בנוי?

ניקח כדוגמא את הפוספוליפידים:

מולקולת שלד- גליצרול- פחמימן שבנוי מ-3 פחמנים.

אל הגליצרול מחוברת שתי חומצות שומן- שרשרת ארוכה של הידרוקרבונים ובקצה קב' קרבוקסילית.

לאחת מקב' ה-OH על הגליצרול מחוברת קבוצת פוספט שאליה מחובר אלכוהול מסויים.

חומצות שומן:

שרשראות פחממניות שמשתנות באורכן  לפי מספר הפחמנים ובדרגת הרווייה שלהן.

חומצת שומן רוויה – רווי במימנים ולכן אין קשרים כפולים. נק' התכה גבוהה יותר.
חומצת שומן בלתי רוויה – לא רווי במימנים ולכן יש קשרים כפולים במקום. נק' התכה נמוכה יותר.

חומצות שומן ארוכות עם יותר פחמנים יעלו את נקודת התכה לעומת חומצות שומן קצרות יותר.

חומצות שומן הן תמיד לא מסועפות. כאשר יש מעט קשרים כפולים החומצות שומן פרושות יותר- מאפשר יותר אינטראקציות בין מולקולריות.

לשתי התכונות האלה יש חשיבות רבה בנוזליות הממברנה.
*שמן לעומת שומן: בשמן יש יותר חומצות שומן בלתי רוויות.

הספירה של החומצות שומן יהיה בהתאמה:

לתרגל להבין איך לקרוא דבר כזה.

יש 3 סוגי ליפידים ממברנלים - פוספוליפידים, גליקוליפידים, וכולסטרול. לכל הליפידים יש מבנה כללי דומה.

פוספוליפידים:

יש שני סוגים

-        כאלה שמבוססים על גליצרול (פוספוגילצרידים):

בממברנה יש 2 חומצות שומן שמחוברות בקשרים אסטרים לשני פחמנים גליצרול. הפחמן ה-3 קשור לקב' פוספט שמחובר לקבוצה אלכוהולית לעתים. יש סוגים שונים של קבוצות אלכוהוליות אפשריות (אתנול, כולין, גילצרול)

כאמור יכולות להתחבר לחומצת שומר רכיב כוהל כמו חומצה אמינית עם כהל וגם השם שלם מושפע בהתאם לדוגמה:

-        כאלה שמבוססים על ספינגוזין - גליקוליפידים:

מולקולת 3 פחמנים, לאחד הפחמנים מוצמדת קבוצת אמינו, לעוד פחמן מחוברת שרשרת אלקלית מאוד ארוכה, וקבוצת OH. לפחמן השלישי מחוברת קבוצת פוספט ואליה מחובר אלכוהול.

נדע אם זה גליקוליפיד הרמז הגדול ביותר הוא לראות קבוצה אמינית NH בשלד בגליצרול זה מעיד על גליקוליפיד. 
לעתים הראש הפולרי במקום יכול להיות בנוי מסוכר או כמה חד סוכרים המחוברים בקשר גליקוזידי. לכן המגוון והשונות נובעת מהשוני בסוכרים הללו (עץ סוכרי). גליקו – סוכר.

כולסטרול:

4 טבעות הידרוקרבוניות מצומדות וקבוצה אלקלית קצרה יחסית. יש לו אופי מאוד הידרופובי, יש לו ראש פולרי קטן (קבוצת OH על הטבעת הקיצונית). לא קיים בפרוקריוטים.

קבוצת OH שלו עוברת אינטראקציה עם ראשים פולרים של ליפידים שכנים ועם הממס.

הכולסטרול נועד לסתום חורים בממברנה והוא שולט על הנוזליות שלה מוריד נוזליות או מעלה בהתאמה.
אם הוא יסתום חורים בין ליפידים אז הוא מוריד נוזליות, לעומת אם הוא נכנס בין ליפידים צמודים הוא מעלה רווח ואז הנוזליות עולה.

אז משותף לכולם שזה מולקולה אמפיפתי ראש פולרי וזנב הידרופובי. הליפידים יכולים להיות שונים בגודל הראש הפולרי (למשל אם יש הרבה סוכרים) דבר המשפיע בפולריות שלהם, וגם אורך התלוי במספר הפחמנים המשפיע על תכונות הליפידים, וסידור בגלל קשרים רווים\לא רווי.

יצורים שחיים בטמפ' מאוד גבוהות:

ארכיאות- מסוגלים להתקיים בטמפ' גבוהה ואפילו משגשגים שמה.

מה בממברנה מאפשר להם להתקיים בסביבה כזו???

הממברנה חייבת להיות כמה שיותר צמיגה:

1. שרשראות ארוכות

2. שרשראות הידרוקרבוניות שהן בלתי רוויות וגם מסועפות. הסיעוף מגן מפני חימצון והירדרוליזה של קשרים, וגם מעלה טמפ' התכה.

3. קשרים אתרים ולא אסטרים

הליפידים הממברנאלים הם אמפיפתיים

הליפידים מסתדרים באופן ספונטני בהתאם למבנה וגאומטריה של הליפידים.
חומצות השומן נארזות בצורה לינראית מקבילה אחת מול השנייה. יש בין השרשראות אינטראקציות.

המבנים שליפידים מסוגלים ליצור ומה משמעותם:

1. מיצלות: מבנה ספירי מעגלי קטן שבו הראשים הפולרים נמצאים במעטפת של הכדור ובפנים יש שרשראות הידרוקרבוניות. המבנה הזה נובע מהאופי האמפיפתי של חומצת השומן. צורת ההתארגנות הזו מאפשרת יצירת אינטראקציות הידרופוביות ולהרחיק חלקים הידרופובים מהממס.

גודל אופייני למיצלות –קוטר nm20. בין הראשים למים יש אינטראקציות פולריות.

התארגנות של פוספוליפידים:

יריעה דו שכבתית bilayer קורה גם באופן ספונטני והחיבור של האזור ההידרופובי נוטה להתחבר בצורה של ליבה הידרופובית והראשים הפולרים מבודדים אותה מהסביבה החיצונית.
ניתן לשלוט בקוטר בהתאם לצורך שלנו לבנות אחת כזו מלאכותית במעבדה.

התכונות החשובות של דו שכבה:

תהליך יצירת הממברנה קורה מעצמו בצורה ספונטנית בגלל האופי האמפיפתי

המבנים האלו מיוצבים ע"י הרבה אינטראקציות שמחזקות זו את זו- קואופרטיביות

1. יכולת ליצור גבולות ארוכים

2. ליפידים נוטים להסגר על עצמם- ליצור מבנים סגורים

3. אם הממברנה נפתחת בגלל תהליך מסויים (סטרס או מבוקר)- יכולה להסגר לבד (self sealing).

4. החלק הפנימי ההידרופובי של הממברנה מהווה כמחסום חדירות

התא חייב להכניס חומרים פנימה ולהוציא חומרים החוצה- לכן הממברנה חייבת להיות חדירה לחומרים שונים.

חדירות הממברנה לחומרים:

התא חייב להכניס חומרים פנימה ולהוציא חומרים החוצה- לכן הממברנה חייבת להיות חדירה לחומרים שונים.
ניתן לבדוק גם באופן מלאכותי כאשר לוקחים ממברנה מלאכותית ולבדוק איזה חומרים עוברים ואיזה לא. ניתן לבדוק באמצעות מדד ריכוז תוך התא לבין חוץ התא ולראות האם בוצע מעבר.
ניתן לראות שלא עוברים בקלות חומרים במיוחד לא יונים כי הם פולרים הם טעונים הם לא יכולים לעבור.
אז איך כן נוכל להעביר חומרים? לשים חלבונים כמו תעלות משאבות טרנספורטרים שיבצעו בקרה על מעבר של חומרים. מעבר באופן סלקטיבי שמעוניין לעבור ע"י חלבונים, הליפידים הם גדר החלבונים הם הדלתות ולכל דלת יש מפתח לחומרים ספציפים שמתאימים ויעודיים לה.

תנועת ליפידים:

הליפידים תמיד נמצאים בתזוזה בתנועה באינטראקציה מסתובבים משנים מקום, הם קשורים ביחד אבל מסתובבים. יש שני סוגים לתנועה:

1.      דיפוזיה ליטראלית – מעבר של ליפידים באותה שכבה באופן מהיר.

2.       פליפ פלופ – מעבר של ליפיד משכבה אחת לשכבה אחרת באופן איטי יותר. פחות מועדף אנרגטית.

תכונות ממברנה – נוזליות:

תכונות של חומצות השומן משפיעות על נוזליות של הממברנה המשפיע על נקודת התכה של הממברנה.
החשיבות של הכולסטרול נכנס בזכות הגודל והמבנה שלו הוא מהווה תפקיד חשוב בממברנה.
כולסטרול ממלא חללים ולכתיב את נוזליות הממברנה בהתאם לאינטראציות שיצור.
הכולסטרול משחק לשני כיוונים ניתן לשים כדי שיהיה יותר נוזלי או פחות בהתאמה.
הוא מהווה כמעין בופר לממברנה, הכנסה של כולסטרול מהווה משחק עם הנוזליות של הממברנה.
הנוזליות משפיעה על נקודת רתיחה, שינויים ברמת חומציות, לחץ מכאני, כל דבר שיכול לשנות את שיווי משקל שלהם .

קשר בין פוספוליפידים:

פוספוליפידים שונים אוהבים להיות ביחד וגם בין סוגים שונים אוהבים להיות ביחד. למשל בנינו פיזור של פוספוליפידים בפיזור אקראי מפוזר ובהמשך ניתן לראות שהליפידים נעו להיות במקבצים בעלי תכונות משותפות ולכן בהתחלה הם ינועו ברמה מאוד גבוהה אחכ הם ימשיכו לנוע אבל פחות. למעשה, ינוע עד שיצור מבנה שמבחינה אנרגטית הכי מועדף על הממברנה וגם אז עדיין ינועו הם תמיד נעים אבל פחות.

וזיקולות מאוד דומות בארגון שלהן לליפוזומים. ווזיקולות הן חלקי ממברנה שסגורים על עצמם בצורת עיגולים וחוסמים בתוכם כל מיני חומרים.

ניתן לבדוק חדירות של ממברנות לחומרים שונים ע"י שימוש בליפוזומים מאחר ואין בהם חלבונים.

ליפוזומים משמשים הרבה פעמים במערכות של העברת תרופות ליעדן. אפשר להנדס ליפוזומים כרצוננו ולהכניס בהן תרופה שתגיע ליעד מסויים בגוף, ולהנדס בהיקף הממברנה של הליפוזומים חלבונים שמכירים אתר מסויים בתא המטרה.

דרך הסתכלות נוספת שמאפשרת לנו להעריך את חדירות הממברנה היא planar bilayers: ממבנרה דו יריעתית שטוחה.

שני תאים שמופרדים ע"י חיץ בלתי חדיר עם חור מאוד קטן במרכז. על החור אפשר ליצור ממברנה דו שכבתית פלנרית שמכסה את החור. עכשיו אפשר לבדוק אם חומרים בצד אחד של התמיסה יכולים לעבור לצד השני.

אפשר לבדוק את מוליכותה החשמלית של הממברנה אם נחבר את כל אחד מהתאים לאלקטורודות ונשרה הפרש מתחים. נראה איך הזרם עובר מצד אחד לשני אם בכלל.

הממברנה כאמור היא גבול חדירות, אבל לא מוחלט.

יש חומרים שונים מסוגים שונים שיכולים לעבור אותה.

מראה סקאלה של מעבר חומרים שונים דרך ממברנה- מדגיש שמדובר בממברנה "יחפה" ריקה מחלבונים.

P= permabillty

היחדידות הן cm/sec

הסקאלה לוגריתמית

(ראה מצגת)

ניתן לראות שיוני סידן, אשלגן, כלור- לא נוטים בכלל לא לעבור

למה? חומרים פולריים.

מים- יכולים לעבור בקצב גבוה- למה?

מולקולות קטנות מאוד והריכוז האפקטיבי שלהן מאוד גדול.

ככל שהחומר הידרפובי יותר הוא יותר ייטה לעבור את הממברנה.

לממברנה בנוכחות חלבונים יש חדירות המאפשרת לה להעביר באופן בררני חומרים נוספים

סוג החלבונים וכמותם תווסת את סוג החומרים והאופן בו החומרים עוברים.

אחוז רווית הממברנה בחלבונים משתנה מתא לתא.

הליפידים הם ממס דו מימדי כאמור המכיל את החלבונים הממברנאליים.

השוואה בין 3 ממברנות:

1. תאי דם אדומים

2. תאי שריר

3. רשתית העין

אם נעשה אנליזה לחלבונים בממברנות הנ"ל: נראה שהממברנות שונות בכמות החלבונים ובטיפוסי החלבונים. כל פס מייצג חלבון שונה.

האופי של כל ממברנה נובע מהרכב החלבונים בה והכמויות שלהם.

החלבונים שיכולים להיות בסביבת הממברנה:

1. אינטגרלים- נמצאים בתוך הממברנה באופן אינטגרלי. האינטראקציה שלהם עם הממברנה מתווכת ע"י אינראקציות הידרופוביות. ניתן להוציא אותם מהממברנה באמצעות דטרגנט שיהרוס את מבנה הממברנה (מלח של חומצת שומן, עם זנב ארוך שמתחרה עם האינראקציה עם הממברנה).

2. פריפריאליים- נמצאים בסביבת הממברנה. או שיהיה מעוגן אליה באמצות אינטראקציה עם חלבון אינטגרלי או באמצעות אינטראקציה עם ליפיד. מה שמעגן אותם זה אינראקציות אלקטרוסטטיות.

אם נוסיף ריכוזי מלח גדולים נעשה מיסוך אינטראקציות חשמליות וככה נוכל להפריד את הממברנה מהחלבונים פריפריאליים.

פתרון מבנים תלת מרחביים של חלבונים ממברנאליים:

קשה מאוד לקבל מבנים כאלה בגלל העובדה שהם נמצאים בתוך הממברנה ולא ניתן לגבש אותם יחד עם הממברנות.

בקטריורודופסין: חלבון שמעורב בשאיבה של פרוטונים מחוץ לתא.

 מורכב בעיקר מסלילי אלפא טרנס ממברנלים (חוצי ממברנה).

הרבה חלבונים שמעורבים במעבר אותות GPR- בעלי צורה של סלילי אלפא שחוצים הלוך וחזור את הממברנה.

האופי של סלילי האלפא הטרנס ממברנלים: בגלל שהם חוצים ממברנה חייב להיות להם אופי הידרופובי. רובם בנויים מח"א הידרופוביות (אלאנין וכאלה...) יש להם גם שיירים פולרים- הם נארזים אחד ביחס לשני ולכן יש גם ייצוב של יחסים פולריים.

אם היה סליל אלפא יחיד- הוא היה הידרפובי לחלוטין.

האם כל החלבונים הממברנלים יורכבו מסלילי אלפא? לא.

חלבון שנקרא "פורין": יוצר תעלה, חור בתוך הממברנה. מורכב ממשטחי ביתא שיוצרים כמו חבית סגורה. מעבירים מהפנים לחוץ מולקולות פולריות. נקרא חלבון inside out- כי החלק ההידרופובי שלו פונה החוצה והפולרי פנימה (בניגוד לרוב החלבונים האינטגרליים).

איך משגיגים מבנה של מעטפת הידרפובית ובפנים פולרי??

משטח ביתא: שיירים פונים מעלה מטה לסירוגין. אלה שיפנו החוצה יהיו הידרפובים ואלה שיפנו פנימה יהיו הידרופילים.

גליקופורין- סוג של גליקופרוטאין, שהוא חלבון טרנס ממסרנאלי. יש לו מתחם חיצוני (פונה החוצה מהתא) שעובר גליקוזילציה רבה. הקשרים בין קבוצות הסוכר לשיירי הסרין הם קשרים O גליקוזידי.

יש לו מתחם אלפא הליקלי יחיד שחוצה את הממברנה- הרצף שלו הידרופובי לחלוטין. בתוך התא יש לו מתחם תוך תאי שיכול לעשות כל תפקוד אנזימטי או יכול להיות חס תפקוד.

האם יש לי דרך לקחת רצף ולדעת- זה המקטע האלפא הליקלי שחוצה את הממברנה?

נחפש לאורך הרצף מקטע ארוך שרובו הידרופיבי- אפשר לעשות את זה בצורה ידנית או בצורה ממוחשבת.

איך עושים זאת באופן ממוחשב?

על כל ח"א יש אופי הידרופובי וגם אופי הידופילי.

נתייחס לאנרגיה החופשית של מעבר של ח"א מסביבה הידרופובית לסביבה מימית.

ח"א הידרופוביות לא אוהבות לעבור לתווך מימי- אנרגיה חופשית חיובית.

לפי האנרגיה החופשית אפשר להרכיב סקאלת הידרפוביות.

נותנים לכל ח"א ערך ורואים איפה סכום הערכים לאורך חלון רץ ייתן לי את הערך הכי גדול- כלןמר הכי הידרופובי.

<מראה גרף>

באופן כזה אנחנו רק יכולים לקבל אינדיקציה- הניבוי הוא לא תמיד נכון.

מודל המוזאיקה הנוזלית

הממברנה במימד הזמן והמרחב אינה קשיחה.

חלבונים יכולים לנוע על פני הממברנה. גם חלבונים וגם ליפידים יכולים לעשות דיפוזה לטראלית.

הדיפוזיה קורית בדו מימד- לא תלת מימד.

לפידים יכולים לעבור דיפוזיה לטראלית מאוד מהירה, ובניגוד לחלבונים יכול לעבור גם דיפוזיה אנכית- לעבור משכבה אחת לשכבה השנייה. זה קורה לאט מאוד. צריך משהו שיקטלז את זה- פליפאזות.

העובדה שהחלבון נשאר באותה האוריינטציה בתוך הממברנה מרגע שנכנס מגדירה מראש את האסימטירה של הממברנה שנשמרת לאורך זמן.

נוזליות הממברנה יכולה להשפיע על הרבה תהליכים ביולוגיים.

כלוסטרול מווסת את הנוזליות של הממברנה- משמש כאנטיפריז לממברנה.

הנוזליות של הממברנה משפיעה על הפונקציונאליות של החלבונים שמפוזרים בה.

איך צובעים ממברנות?

צביעה ייחודית באמצעות מלחי מתכות כבדות.

חלק 9: פחמימות

יש כמה סוגים עיקריים של מאקרומולקולות גדולות חשובות: חלבונים, דנ"א, רנ"א, והיום נתחיל ללמוד על פחמימות ותפקדיהן. שיעור הבא נלמד על חומצות שומן ושומנים.

מסלולים מטאבוליים וכל מיני כיף...

מה התפקיד של סוכרים ורבי סוכרים בתהליכים של מטאבוליזם... מרתק מרתק...

פחמימות הן מבנים פחמניים שיש בהם קב' אלדהידית או קטונית והרבה קב' הידרוקסיל. קרבוהידרטים הם בעלי תפקידים רבים בתהליכי החיים.

התפקיד הראשון שלהם הוא בעצם למשש בחומרי דלק, מחסני אנרגיה. גלוקוז הוא חד סוכר חשוב מאוד שניתן להפיק ממנו אנרגיה בתהליכים מטאבוליים חשובים.

חדי סוכרים משמשים כחומרי דלק וחומר תשמורת עתירי אנרגיה.

בנוסף סוכרים מששמשים כתשתית מבנית לחומצות גרעין.

הרבה פעמים פוליסוכרים משמשים כאלמנטים מבניים שמרכיבים דפנות של תאי צמח, תאי חיידקים. סוכרים הרבה פעמים מעורבים במגוון עצום של תהליכי היכרות בין תא לתא. הם מתווכים תקשורת בין תאים.

הם מעורבים בתקשורת של התא עם סביבתו. הרבה פעמים תא מגיב לסביבתו באמצעות עצים סוכריים. תא נצמד למשל משטח באמצעות אינטראקציה של האלמנטים הסוכריים במעטפת שלו עם המשטח.

הם משמשים הרבה פעמים כרצפטורים לוירוסים, חיידקים. הרבה פעמים וירוסים מזהים תאים לפי אלמנטים סוכריים על המעטפת שלהם.

סוכרים יכולים לשנות תפקוד ויציבות של חלבונים.

בקיצור שלל תפקידים גדול. רוב הביומסה על כדה"א מורכבת מהם.

סוכרים:

פחמימות קטנות ופשוטות. יכולים להתחבר לסוכרים אחרים בכל מיני אפשרויות חיבור. סה"כ האינפורמציה שיש בעצים סוכריים היא אדירה ומגוונת ומתאימה לתפקוד של תיווך בין תאים ובין תא לסביבתו.

לח"א יש 20 ח"א עם מגוון גדול של אפשרויות חיבור.

הפוטנציאל של המגוון של חיבורי סוכרים שונים הוא עצום. המון אינפורמציה קשורה בעצם בסוכרים.

חד סוכר: (CH₂O)n

שרשרת בלתי מסועפת שעל כל פחמן שלה קשור חמצן.

לכל סוכר יש קב' אלדהידית או קטונית. קב' אלדהידית היא מאוד ריאקטיבית.

יש הרבה קבוצות כהליות. חד סוכרים הם למעשה פוליאלכוהול.

הפחמימן הכי פשוט:

3 פחמנים.

אטום פחמן א-סימטרי- ולכן יש שני איזומרים- D,L. רוב הצורות בסוכרים היא D. הקונפיגורציה נקבעת על פי הפחמן הכי רחוק מהקב' האלדהידית – הסטריאואיזומריה, תמונת ראי של אחת השנייה.

אטום פחמן מס' 1 הוא זה שמחובר לקב' האלדהידית או הקטונית.

כל הסוכרים שיש להם קב' אדלהידית נקראים אלדוז.

כל הסוכרים שיש להם קב' קטון נקראים קטוז.

חד סוכרים יכולים להכיל כאמור 3 פחמנים, יכולים להכיל גם 4, 5, 6, 7... ויותר...

5 פחמנים: אלדופנטוזות. 6 פחמנים: אלדוהקסוזות..

<<לא סגורה על ההגדרות של מיספור הפחמנים והשמות- להסתכל במצגת>>

תמיד לקטוזות יש אטום פחמן אסימטרי אחד פחות מול אלדוז המורכב מאותו מספר פחמנים.

איזומריזציות:

1. איזומרים של קונפיגורציה- סטריאו- איזומרים: בעלי אותה נוסחה, אבל קונ' מרחבית שונה- D, L. איזומר הוא מי שיש לו פחמן כיראלי (4 קבוצות שונות על הפחמן).

* אננטיומרים: תמונת ראי אחד של השני.

* דיאסטריומריים: איזומרים שאינם אננטיומרים- אינם תמונת ראי אחד של השני.

* אפימרים: מקרה פרטי של דיאסטריומרים- דיאסטריומרים ששונים זה מזה בקונ' של פחמן אסימטרי אחד בלבד.

חד סוכרים שמורכבים מ-5 או 6 אטומי פחמן:

יש להם נטייה לעבור ציקליזציה- הפיכה למבנה טבעתי.

יכולים להסגר לטבעות של 6 (pyran) או 5 (Furan)

אלדהידים וקטונים הם קבוצות מאוד ריאקטיביות. יש ריאקציה של אלדהיד עם קבוצת אלכוהול ואז שבירה של קשר כפול ויצירת המיאצטל.

גם קטון יכול לעבור את אותה הראיקציה. קטון+ כוהל = המיקטל.

אלדהידים וקטונים מגיבים עם כוהל ויוצרים טבעת ציקלית.

בתגובת הציקליזציה מקבלים אטום פחמן אסימטרי נוסף. הוא מוגדר כאטום פחמן אנומרי. (פחמן 2 בציור במצגת). קבוצה ה-OH שנוצרה בריאקציה יכולה להיות או מתחת למישור הטבעת או מעליו.

(מעל או מתחת מוגדר לפי מיקום המתמיר על פחמן 5- כאשר הוא מוגדר תמיד למעלה)

אם מתחת- זו קונ' אלפא. אם מעל- קונ' ביתא- אלפא וביתא הם אנומרים אחד של השני.

פרוקטוז יכול לתת טבעות של 6 או 5. סה"כ 4 קונ' שונות- 2 עבור כל טבעת (להסתכל ציור במצגת)

בתוך תמיסה פרוקטוז ייטה להיות בצורה של משושה. בתוך מולקולה רב סוכרים פרוקטוז יעדיף להיות בצורה של טבעת מחומשת.

בשביל לעבור מאנומר אחד לאחר הוא צריך להפתח.

המעבר בין אנומרים הוא דרף מעבר בצורה הפרושה.

לכל צורה אנומרית יש פעילות אופטית בגלל שיש לה מרכזים כירליים. לכל אחד מהאנומרים יש אינטראקציה אחרת של אור מקוטב- אלפא וביתא.

ז"א אם נבדוק פעילות אופטית נוכל להסיק על הרכב התערובת.

2. איזומרים של קונפורמציה:

אותה קונ' סטריאוכימית אבל מבנה תלת מרחבי שונה.

·       בהקשר של פחממני 6 מדובר בצורות של "כיסא" או "סירה". מתמירים אקסיאלים- בניצב למישור המולקולה. מתמירה אקווטוריאליים- מקבילים למישור הטבעת.

עבור פחממני 6 הצורה היותר יציבה היא צורת הכיסא כי עבורה כל המתמירים האקסיאליים הם מימנים- וככה נוצרת הכי פחות הפרעה סטרית.

מתמירים אקווטוריאלים פונים החוצה ולכן יש פחות דחייה סטרית.

שורה תחתונה: עדיף לשים מתמירים גדולים במיקום אקווטוריאלי.

·       איזומריזציה מרחבית בהקשר של טבעות מחומשות:

הקונ' המדוברת במקרה זה מכונה "מעטפה". 4 אטומים נמצאים על אותו מישור והחמישי נמצא מעליו ולכן מתקבלת צורת מעטפה. או שאטום פחמן מס' 3 יהיה מעל המישור- C 3 אנדו. או שפחמן 2 יהיה מעל המרחב- ואז זה ייקרא C 2 אנדו.

עוד תכונות של חד סוכרים

חד סוכרים נוטים לעבור חימצון ע"י חומרים מחמצנים. החימצון יכול להתבצע ע"י ריגאנטים מחמצנים כמו נחשות בריאקציה ח"ח. המבחן שבו סוכר עובר חמצון נקרא מבחן סוכר מחזר. הסוכר בעצם מחזר את הריאגנט (נחושת למשל). החימצון הזה יכול לקרות רק מהצורה הפתוחה, כאשר יש לי קבוצה אלדהידית. אם הסוכר נמצא בצורת טבעת הוא לא יכול לעבור חימצון. הוא חייב להפתח כדי שתהיה קבוצה אלדהידית שתגיב.

ברגע שמגיבים סוכר עם חומר מחמצן המולקולות ייטו לעבור לצורה הפתוחה ואז יגיבו ויתחמצנו.

איך מתחברים חד סוכרים ליצירת פולי סוכרים?

סוכרים מתחברים זה לזה בקשרים שנקראים "קשרים גליקוזידים". הם יכולים להגיב עם כהלים או אמידים.

יש שני סוגי קשרים גליקוזידים:

קשר O גליקוזידי= קשר שמתווך ע"י אטום חמצן.

קשר N גליקוזידי= קשר בין חנקן לפחמן.

ההבדל בין סוכר חופשי לסוכר גליקוזידי:

סוכר גילקוזידי לא יכול לעבור חזרה לצורה הפתוחה (לא יגיב במבחן סוכר מחזר). זה בגלל שקבוצת OH שלו הגיבה עם מתיל כלשהו?

אם הפחמן האנומרי חופשי הסוכר יכול להפתח בחזרה. אם הפחמן האנומרי קשור בקשר גליקוזידי לסוכר הבא, הוא לא יכול להפתח.

יש הרבה אפשרויות ליצירת קשרים גליקוזידיים. סוכרוז הוא הדו סודר הכי נפוץ. מורכב מחיבור של טבעת פרוקטוז לטבעת גלוקוז.

על מנת שטבעת סוכרים תוכל להפתח חזרה הפחמן האנומרי בלבד הוא זה שצריך להיות חופשי.

הפחמן האנומרי תמיד מוגדר פחמן מספר 1.

גליקוזידזות: אנזימים שמפרקים קשרים גליקוזידים.

בדופן החיידק יש פולימר רב סוכרים שבנוי משתי יחידות שחוזרות NAG. NAM

 יש שמה קשר N גליקוזידי בין השיירים ו-O גליקוזידי בין NAG ו NAM.

האנזים למעשה שובר את הקשר ה-O גליקוזידי בין NAG ל-NAM.

המנגנון כולל קטליזה חומצית ויצוב של חומר ביניים, מתבצע ע"י ליזוזים. קטליזה חו"ב, התקפה נוקלאופילית...

פוליסכרידים

פולימרים גדולים שבנויים מיחידות חד סוכריות שמחוברות בקשרים גליקוזידים.

יש להם תפקידים חשובים בעיקר באיחסון אנרגיה, תמיכה מכנית

יש סוגים שונים של פוליסכרידים כתלות בסוג הסוכר שנחבר.

סוג מיוחד של פוליסכריד הוא כזה שבנוי מיחידות חוזרות של גלוקוז:

צלולוז ועמילן בצמחים, ביונקים גליקוגן. אלה מולקולות עתירות אנרגיה.

צלולוז הוא הומופולימר של גלוקוז (בנוי רק מגלוקוז). הוא לא מסועף. יחידות סוכר שמחוברת בקשרים O גליקוזידים מטיפוס ביתא 1-4.

האנזים שמפרק צלולוז נקרא צלולאז. הוא קיים בחיידקים. לא קיים בבני אדם. מבחינתנו לצלולוז אין ערך תזונתי, אלא ערך דיאטטי- נותן תחושת שובע.

פולימר 1-4 של צלולוז הוא לינארי. הוא יוצר סיבים ע"י קשרים אינטרמולקולרים- מספר מולקולות צלולוז שיוצרות קשרי מימן ביניהן יוצרות סיב.

לצלולוז בתאי צמח יש תפקיד סטרטורלי- מאוד יציב.

עמילן וגליקוגן:

יש חיבור של סוכרים בקשר אלפא 1-4.חיבור כזה יוצר יוצר פולימר כפוף (לא ישר כמו בצלולוז). ככה נוצר סליל מאוד ארוך מכופף.

מה שיבדיל בין עמילן לגילקוגן הוא צורת הסיעוף.

בני אדם מסוגלים לפרק עמילן ע"י אנזים שנקרא עמילאז.

גליקוגן הוא הומופולימר של גלוקוז שיוצר שרשראות ארוכות בקשר אלפא 1-4. יש סיעוף נוסף במולקולות הגליקוגן כאשר שרשרת נוספת יכולה להצמד לשרשרת קיימת בקשר אלפא 1-6 בקשר או גליקוזידי. הסיעוף כאן הוא כל 10 יחידות.

גליקוגן הוא חומר עתיר אנרגיה שנמצא בתא והוא מאוד זמין. האנזים שמפרק אותו בתור התחלה הוא גליקוגן פוספרילאז. כל פעם ישש עודף גלוקוז בתא הוא מסונתז לגליקוגן.

עמילן: יכול להיות או שרשרת לא מסועפת בכלל עם קשרי אלפא 1-4. עמילן יכול להיות גם מסועף בסיעוף אלפא 1-6. זה יכול לקרות כל 30 יחידות סוכריות.

סוכרים יכולים להיות מותמרים בדרכים שונות ומגוונות.

לכל רב סוכר יש פונקציה שונה בהתאם להרכב היחידות הסוכריות שלו.

סוכרים מותמרים יכולים להיות מחוברים לפוליסוכרים.

גליקואמינוגליקאן: פולי סוכרים בעלי אופני אניוני. הם מורכבים מיחידות סוכריות מותמרות כמו קב' קרבוקסיליות, קבוצות סולפטיות. אם נחבר יחידות כאלו נקבל פוליסוכר שנקרא גליקואמינוגליקאז.

אפשר להצמיד אותם לחלבונים למשל.

נמצאים בעיקר בפני שטח של תאים. כשנחבר אותם לחלבון נקבל פרוטאוגליקן= רב סוכר גלוקוזאמינוגליקאן + חלבון

גליקופרוטאינים: רוב המסה היא חלבונית ולא סוכרית.

קשרים גליקוזידים משני טיפוסים יכולים לחבר בין החלבון לסוכר.

שייר סרין או טריאונין בחלבון יכולים להקשר בקשרים O גליקוזידים לסוכרים.

למשל אם נחבר אן אצטיל גלקטוז אמין בקשר O גליקוזידי לשייר סרין בחלבון.

חומצה אספרגינית היא כזו שיש לה קבוצה אמינית בסוף. היא יכולה להקשר בקשר אן גליקוזידי לסוכר אחר.

עצים סוכריים יכולים להצמד לחלבונים דרך שיירי אספרגין בקשרים אן גליקוזידיים. תמיד כשיש גליקוזילציות מטיפוס N יש יחידה בסיסית שתמיד חוזרת שיוצרת עצים סוכריים שונים.

האם ניתן לדעת איזה שייר אספרגין יעבור גליקוזילציה מטיפוס N?

בד"כיש רצף קונצנזוס שיגדיר איזה שייר יעבור גליקוזילציה. הקוצנזוס הוא

אספרגין- ח"א כלשהיא- סרין או טריאונין.

O גליקוזילציה מתרחשת רק על סרין או טריאונין (מתרחש ב-ER או בגולג'י)

N גליקוזילציה מתרחשת על אספרגין.

החלבונים שעוברים את ההתמרות הסוכריות האלה הם לרוב כאלה שמופרשים החוצה או שהם ממברנליים- כאשר מעוגנים לצד שפונה החוצה.

יש המון סוגי אוליגוסכרידים. יכול להיות עץ סוכרי שמורכב בעיקר ממנוזים. השוני הוא לא רק בהרכב העץ אלא גם באופן החיבור שלו אליו.

מדובר באינפורמציה אדירה שמנוצלת בצורה ספציפית ע"י התא לצרכיו.

כל הרכבה של העצים הסוכריים מתרחשת ע"י אנזים שנקרא גליקוזיל טרנספראז.

אלסטאז: אנזים שעובר גליקוזילציה. העצים הסוכריים שמחוברים אליו משפיעים על פעילותו, יציבותו.

עצים סוכריים אחראיים לעניין של זיהוי עצמי בסוגי דם:

סוגי דם שונים נבדלים ביניהם זה מזה בסוג העץ הסוכרי שמורכב על חלבונים ממברנליים של תאי הדם האדומים.

גליקוזיל טרנספראזות- A B הם הומולוגיים אחד לשני. יש להם שוני ב-4 ח"א בלבד אשר מכתיב ספציפיות שונה. הם מוסיפים יחידת סוכר נוספת לעץ הסוכרי שיוצרת את ההבדל בין סוגי הדם השונים.

שני האנזימים האלו לא נמצאים אצל מי שיש לו סוג דם O.

<<להשלים>>

תקשורת בין תאים

לקטינים: חלבונים סלקטיבים לקב' סוכריות מאוד סציפיות.

נמצאים על מעטפות של תאים.

הלקטינים מזהים סוכרים שמבוטאים בתאים שכנים. לקטין יעבור אינטראקציה לסוכר שהוא ספציפי אליו בתא שכן. תיווצר אינטראקציה (יחסית חלשה).

וירוסים:

תקשורת בין תא מארח לבין וירוסים:

וירוסים תופקים את תאי המטרה שלהם. מבאים חלבון שנקרא המגלוטינין. יש לו אתרי קישור לקבוצות סיאליות (סוג מסויים של סוכר) שמבוטאות בתא המטרה. יש קשירה בין החלבון של הוירוס לסוכר בתא המטרה.

לסיכום:

הסוכרים משמשים להעברת מגוון אינפורמציה אדירה.

דרך לעשות אנליזה לעצים סוכריים:

מס ספקטרומטריה: נעשה אנליזות של זה יחד עם אמפליקציה של גליקוזידזות. בצירוף של חיתוכים ספציפים ומס פק נוכל לקבוע את העצים הסוכריים.

טרנספורט דרך ממברנות בתאים

זה נושא על מעבר חומרים דרך ממברנות אחרי שיעור של ליפידים וממברנות, אחרי שמבינים איך בנוי הממברנה עצמה.
אז על מה נדבר? איך תאים מתווכים מה יוצא ונכנס מהתא? איך שומרים על הסביבה הפנימית כמו יונים מחוץ התא. הכול תוך היעזרות בחלבונים שמסייעים לתהליך.

ממברנה דו שכבתית פוספוליפידים הידרופובית באמצע לעומת חוץ פולרי חצי חדירה . החלבונים על הממברנה מאפשר תנועת חומרים ומאפשרת מעבר.
ממברנה לא חדירה סתם כך עבור יונים טעונים גם אם הם קטנים, לעומת מים מולקולה פולרית לא טעונה ומצליחה לעבור יותר בחופשיות.
יש חשיבות לשמר ריכוזים של חומרים מסוימים בתוך התא לעומת חוץ התא, או לדאוג שלא ייכנסו חומרים לא נחוצים לתוך התא. אז מה מאפשר את הבררנות הזו?
אז יש שלושה סוגי חלבוני ממברנה נבדלים זה מזה בסוג הקשר שלהם עם הממברנה:
1. חלבוני ממברנה אינטגרלים – חלבונים הקשורים בצורה חזקה מאוד עם הממברנה פיזית.
2. חלבוני ממברנה היקפיים – פריפריאליים – חלבונים הקשורים רק לצד אחד של ממברנה או חיצוני או פנימי ע"י קשרים אלקטרוסטטים וקשרי מימן.
3. חלבונים טראנס ממברנליים – חלבונים החוצים ממברנה מצד לצד. כך שהאזור החוצה ממברנה יהיה הידרופובי גם כדי שיוכלו להתחבר ולהתחזק אחד עם השני טוב.

ממברנה סינטטית היא ממברנה שיכולה להיות מלאכותית ללא חלבונים, או שנוכל לשתול בה חלבונים שנרצה כדי לבחון לחקור וללמוד על טרנספורט בממברנות. ממברנה ביולוגית היא ממברנה רגילה עם חלבונים. 

1. משאבות יהיו בצד הפנימי של התא, הידרוליזה של ATP שנועד לפרק את ATP ולכן הוא פנימי.
   משאבות מתבצעות תוך השקעת אנרגיה ATP !
   
   2. תעלות נמצאות במצב סגור ויכולות להיפתח ע"י ליגנד לתעלה (מכיוון חיצוני או פנימי) וגורם לפתיחה שלה ואז ינוע עם מפל הריכוזים ויעצור עד השוואת מפל ריכוזים או עד שהתעלה נסגרת חזרה ולא תמיד בהשוואת ריכוזים. אחכ יכנס לפעולה משאבות כדי לשמר את הפערים הללו.
   מתח חשמלי ע"י פוטנציאל ממברנה הוא ערך שניתן למדוד אותו חשמלי (וולט) ושינויים בפוטנציאל ממברנה זו דרך של מע' העצבים להעביר סיגנל דרך אקסונים. יווצרות גל שגורם לו לפתוח או לסגור.
   ההפרש המתחים יגרום להפעלה של חלבון להעברה לצורך איזון המתח . זה טריגר להפעלה .
   תעלות מבצעות את פעולתן באמצעות דיפוזיה פשוטה מעבר חומרים מריכוז גבוה לריכוז נמוך דרך התעלות הפתוחות.
   
   3. טרנספורטרים ספציפים לחומרים מסוימים (נשאים, חלבוני נשא) יכולים לשנות את הקונפורמציה שלהם באופן מסוים. נכנס חומר לתעלה הפתח נסגר ואז נפתח הצד השני שלו. כמו חדר צילום או חדר של תקשורת אתה נמצא בין שני דלתות או בחממה שלנו.
   חלבוני נשא אלו מתבצעים באמצעות דיפוזיה מזורזת הם קושרים את חומר אותו רוצים להעביר מצד אחד והחלבון נשא עובר שינוי ומעביר את החומר לצד השני ביחס למפל הריכוזים.

מנגנוני חלבוני נשא לדיפוזיה מזורזת:
- יוניפורט – מעביר מולקולה מסוג אחד בכיוון אחד
- אנטיפורט – מנגנון העברה של מולקולות מסוג אחד פנימה תוך הוצאה של החוצה של מולקולות מסוג אחר.
- סימפורט – מעביר מולקולות משני סוגים שונים באותו הכיוון.
- אלקטרוגני – מייצר שינוי במטען כתוצאה מהעברת מולקולות מצד אחד לשני.
- אלקטרונייטרלי – אינו מייצר שינוי במטען כתוצאה מהעברה.

בהקשר לחלק זה:

הובלה אקטיבית ראשונית – מבוצעת תוך השקעת אנרגייה ע"י משאבות מכניס חומרים כנגד מפל הריכוזים הקיים.

הובלה אקטיבית שניונית – חלבוני נשא מנצלים את מפל הריכוזים שנוצר ע"י המשאבה לצורך הוצאת החומר שהוכנס לטובת הכנסת מולקולה אחרת במקומו ללא השקעת אנרגיה. כלומר יש כאן ניצול של מפל ריכוזים שנוצר כדי להכניס מולקולה אחרת. יכול להיות בתצורת סימפורט או אנטיפורט.

חשוב לדעת ! הממברנות הביולוגיות הן א-סימטריות הן לא בנויות בכל צד באופן דומה לצד השני כמו למשל חיבור חלבונים באופן שונה או אחר. יכול להיות שבתוך התא יש יותר חלבונים לעומת חוץ התא.

P-Type ATPase הן משפחה גדולה ומגוונת של חלבונים המסייעים בהובלה אקטיבית של יונים ומולקולות קטנות דרך ממברנות ביולוגיות. הן משמשות כמשאבות המניעות חומרים נגד מפל הריכוז שלהם, תוך שימוש באנרגיה המופקת מהידרוליזה של ATP.

P – יש כאן קשר קוולנטי רגעי בין פוספט לבין חומצה אמינית שיוצר את הפתיחה וסגירה כל פעם בצד אחר. מהווה את השינוי קונפורמציה.

תעלות:
שינוי משמעותי בפוטנציאל ממברנה בטווח זמן קצר מאוד מילי שניות קרוב לדיפוזיה החופשית.
דפולריזציה ורפולריזציה בגבעה - תעלות יוניות תלויות מתח.

תעלה היא סלקטיבית למולקולה אותו היא מעבירה, היא מבוטאת באמצעות קורדינאציות גם בגודל וגם בקשרים

מודל מתאר תעלת נתרן.
יוצרים קשר עם התעלה והם עוזבים באמצעות דחיפה ע"י דחייה אחד דוחה את השני וכל פעם יונים חדשים שרוצים לעבור דוחים הלאה את היונים. הרי הם חיוביים והם יגמרו למצב שבו אחד דוחה את השני הלאה קדימה לעבור בתעלה וכך כולם מתקדמים אחד אחריי השני במרחק.

תעלות תלויות מתח אזור S4 משתנה בהתאם למתח ויוצר לשינוי קונפורמציה לפתיחה או סגירה של תעלה.

יש אזור חשוב שמגדיר את השינוי קונפורמציה שמזהה שינוי מתח.

קיום שייר משפיעה על כמה זמן התעלה תהייה פתוחה

תעלה תלוית ליגנד שהוא אצטיל כולין מהווה רצפטור .
היא יכולה לייצר מתח שתגרום המשכיות.

אנדוציטוזה תא מכניס חומרים פנימה
אקסוציטוזה תא מוציא חומרים החוצה